糖尿病研究模型

1、糖尿病藥理學(xué)研究方法,楊曉春,目 錄,糖尿病的發(fā)病機制,糖尿病的治療靶點,糖尿病的模型,糖尿病的藥理學(xué)研究方法,什么是糖尿?。?糖尿?。╠iabetes mellitus）是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病時長期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。,糖尿病的發(fā)病機制,分型 1型糖尿?。河捎谝葝uβ細胞破壞而

2、導(dǎo)致內(nèi)生胰島素絕對缺乏。 2型糖尿病：不同程度的胰島素分泌障礙和胰島素抵抗并存的疾病。,糖尿病的發(fā)病機制,表現(xiàn)：三多一少,糖尿病的發(fā)病機制,糖尿病的并發(fā)癥,1型糖尿?。好庖呦到y(tǒng)缺陷和遺傳等因素。童年時期就發(fā)病。終身注射胰島素。2型糖尿病：高糖素樣多肽一、胰腺中的胰島、胰島素受體的功能障礙。后期發(fā)病。,糖尿病的發(fā)病機制,糖尿病的發(fā)病機制,,小腸中的多肽一發(fā)現(xiàn)血糖水平升高。報告給胰腺。胰腺通知胰島分泌胰島素。胰島素在胰島素受體的配

3、合下降低血糖。,糖尿病的發(fā)病機制,肥胖導(dǎo)致的糖尿病,糖尿病的治療靶點,,,體外研究模型基于靶點的細胞模型基于表型的細胞模型體內(nèi)研究模型正常動物糖尿病模型自發(fā)性糖尿病動物模型實驗性糖尿病動物模型基因工程糖尿病動物模型,,,,糖尿病的模型,基于靶點的細胞模型 以受體為靶點的細胞模型 以胰島素信號通路為靶點的細胞模型 以鈣通道和KATP 通道為靶點的細胞模型基于表型的細胞模型 胰島素抵抗細胞模型 葡萄糖消耗運轉(zhuǎn)細胞模

4、型,糖尿病體外研究模型,GLP-1的生理作用,以受體為靶點的細胞模型,GLP-1受體,,,cAMP,,GLP-1受體細胞模型,膜受體：GLP-1； 核受體：PPARγ 。,以胰島素信號通路為靶點的細胞模型,胰島素信號通路,,,,,報告基因技術(shù),以鈣通道和KATP 通道為靶點的細胞模型,鈣離子信通路,膜片鉗系統(tǒng),膜片鉗技術(shù),膜片鉗的原理,胰島素抵抗細胞模型,細胞HepG: 肝胚胎瘤細胞3T3-L1: 脂肪纖維細胞C2C12 :成肌

5、細胞,,造模處理：高濃度胰島素高糖高脂地塞米松衣霉素棕櫚酸,,檢測指標：細胞活性葡萄糖消耗量,葡萄糖消耗運轉(zhuǎn)細胞模型,培養(yǎng)液：葡萄糖+氚標葡萄糖,培養(yǎng),液閃儀檢測,,,葡萄糖消耗運轉(zhuǎn)細胞模型,培養(yǎng)液：葡萄糖,培養(yǎng),,,葡萄糖檢測,,細胞量檢測,葡萄糖氧化酶法己糖激酶法血糖儀檢測連續(xù)式血糖檢測儀無創(chuàng)式血糖監(jiān)測,,,,血糖的檢測方法,檢測原理,葡萄糖氧化酶法,己糖激酶法,在己糖激酶催化下，葡萄糖和三磷腺苷(ATP

6、)發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)與二磷酸腺苷(ADP)。前者在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)催化下脫氫，生成6-磷酸葡萄糖酸(6-GP)，同時使氧化型輔酶Ⅰ(NADP)還原成還原型輔酶Ⅰ(NADH)。NADH的生成速率與葡萄糖濃度呈正比，NADH在340 nm有特異吸收峰，在波長340 nm處監(jiān)測吸光度升高速率，計算血清中葡萄糖濃度。,血糖儀檢測,全自動生化儀,血糖儀檢測,連續(xù)式血糖檢測儀,2018年，美國

7、FDA批準Senseonics公司的Eversense連續(xù)血糖監(jiān)測（CGM）系統(tǒng)用于18歲以上的糖尿病患者。完全植入、可用90天的血糖檢測傳感器的CGM系統(tǒng)。,無創(chuàng)式血糖監(jiān)測,根據(jù)其工作原理，可分為下列四類： 利用皮下間質(zhì)液中的糖分子測試血糖值。皮下間質(zhì)液可以有少量滲出皮膚，無創(chuàng)得到皮下間質(zhì)液樣品，測得血糖值。 通過人體對近紅外線、中紅外線或遠紅外線的頻譜分析，提取血糖值。當用紅外線照射人體時，代表血糖特征的反射或吸收紅外線，稱為

8、血糖特征頻譜信號，可用來提取血糖值。 測試人體的射頻阻抗，提取血糖值。當波長較紅外線更長的電磁波對人體輻射時，像血糖這種非離子可溶性物質(zhì)，將吸收一定的電磁波，提取其吸收特征值，理論上可以得到血糖值。 根據(jù)糖尿病人血液中糖化蛋白比例較高這一特征，通過對眼球測試，得到血糖值。,糖尿病體內(nèi)研究模型,體內(nèi)研究模型正常動物糖尿病模型自發(fā)性糖尿病動物模型實驗性糖尿病動物模型基因工程糖尿病動物模型,正常動物糖尿病模型,以正常動物為實驗對象

9、，對給藥后動物體內(nèi)葡萄糖的濃度變化進行研究的模型。 特點：影響因素較少，可直接反應(yīng)藥物的降糖作用，缺點是非病理模型，不能反映對疾病的治療作用。常用的模型： 糖耐量試驗 糖鉗試驗,實驗動物：大鼠、小鼠,糖耐量試驗,,,給藥,大、小鼠,,給葡萄糖 5g/kg,,眼眶采血,頸靜脈采血,剪尾采血,糖耐量試驗,,,葡萄糖檢測,,如何判斷抗糖尿病藥物的治療效果？,糖耐量試驗,,,CmaxAUC,AUC的計算,,,梯形法積分法,糖耐量試

10、驗,,,,,,,糖鉗實驗,葡萄糖鉗夾技術(shù)（Glucose clamp technique），是一種定量檢測胰島素分泌和胰島素抵抗的方法，被認為是現(xiàn)今最新的葡萄糖穩(wěn)態(tài)的測量技術(shù)。,葡糖鉗分類 高胰島素-正常血糖鉗夾 通過外周靜脈灌注，使受試者血清胰島素水平上升并維持在約100muU/ml。給予受試者20%葡萄糖的灌注，且使得血糖濃度維持在正常水平?？梢杂糜谠u估外周組織對胰島素的敏感性。 高葡萄糖變量鉗夾 通過血糖灌注使

11、受試者血糖水平上升維持在7.0mmol/L。通過檢測保持在高水平血糖情況下葡萄糖的灌注量，從而評價葡萄糖代謝率。可以評價β細胞對葡萄糖的敏感性。,血糖升高時，胰島素分泌增加，并通過增加攝取、存儲和利用葡萄糖等方式，下調(diào)血糖；血糖下降，胰島素分泌降低，胰高血糖素等升糖激素增加，促進代謝分解，加速糖原分解和葡萄糖異生作用，升高血糖。,技術(shù)原理,1、葡萄糖—胰島素負反饋體系,正糖鉗技術(shù)通過同時輸注可控濃度及速率的外源性胰島素和葡萄糖，打破體內(nèi)

12、葡萄糖一胰島素的負反饋調(diào)控，使血漿外源性胰島素維持在較高濃度水平，而血糖維持在基礎(chǔ)穩(wěn)態(tài)水平。,技術(shù)原理,2、鉗夾技術(shù)原理,由于血漿外源性胰島素的優(yōu)勢濃度，抑制了內(nèi)源性葡萄糖（肝糖分解和糖異生）和內(nèi)源性胰島素分泌，此時外源性葡蔔糖輸注速率等于外周組織的葡萄糖利用率，從而評價葡萄糖、胰島素以及其他相關(guān)物質(zhì)的代謝過程。,,,1.避免內(nèi)源性胰島素缺乏（如糖尿病患者）及低血糖對胰島素敏感性測定的影響。2.將內(nèi)源性干擾減至最小，增加了實驗的可控性

13、與準確性，降低了結(jié)果的變異性。,實驗技術(shù)特點,1.不同受試者的應(yīng)激反應(yīng)和血管緊張度等諸多因素會對穩(wěn)態(tài)的建立產(chǎn)生一定的影響。2.該技術(shù)復(fù)雜耗時、費用昂貴，實驗中需頻繁取血。,優(yōu)點,缺點,犬禁食12h后，稱重、測血糖。,犬糖鉗實驗,開通靜脈通道，與三通管相連，一進口端輸注胰島素，另一進口端輸注10％葡萄糖。,分別從靜脈恒速輸注胰島素和10％葡蔔糖溶液。每隔10min取血測定血糖，根據(jù)所測血糖值調(diào)整葡萄糖輸注速率至穩(wěn)態(tài)。,,犬糖鉗實驗,自發(fā)

14、性糖尿病動物模型,表現(xiàn)為高血糖、胰島素抵抗,動物來源相對較少,未經(jīng)任何的人工處理,自然狀態(tài)下發(fā)生,模型更接近人類糖尿病的自然起病及發(fā)展,飼養(yǎng)、繁殖條件要求高,動物昂貴,模型特點,,,模型不足,自發(fā)性糖尿病小鼠模型是指未經(jīng)任何有意識的人為處置，在自然條件下發(fā)生糖尿病的小鼠模型。,,自發(fā)性糖尿病動物模型,,自發(fā)性糖尿病動物模型,db/db小鼠 美國Jackson實驗室于1966年發(fā)現(xiàn)的位于4號染色體的Leptin受體基因缺陷

15、導(dǎo)致的自發(fā)性2型糖尿病小鼠，從四周齡即出現(xiàn)貪食、肥胖，隨周齡增加而出現(xiàn)明顯的高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特征，其發(fā)病過程與2型糖尿病患者非常相似。,自發(fā)性糖尿病動物模型,ob/ob小鼠帶有ob基因(obese)。為6號染色體隱性基因，純合子導(dǎo)致單純肥胖伴晚期糖尿病。2周齡時肥胖個體外表上有別于正常個體。在8～9月齡時，動物體重增加到最大值，約為70克，多種代謝失調(diào)，包括脂肪形成增加，脂肪分解減少。代謝失調(diào)與過食癥和胰島素分泌過多有關(guān)

16、，動物在6～9周齡時有中度的高血糖，但12～16周后自發(fā)消失。肥胖癥與人類的肥胖癥相似。用于肥胖癥的生化、癥理、激素及藥物治療等的研究。,實驗性糖尿病動物模型,實驗性糖尿病動物模型是指通過物理、生物、化學(xué)等致病因素人工誘發(fā)出的具有糖尿病特征的動物模型。,具有耗時短，方法簡便，易于掌握，重復(fù)性好的特點，短期內(nèi)可誘導(dǎo)出大量模型。,實驗性糖尿病動物模型,手術(shù)誘導(dǎo)飲食誘導(dǎo)化學(xué)藥物誘導(dǎo)聯(lián)合誘導(dǎo),實驗性糖尿病動物模型-手術(shù)誘導(dǎo),手術(shù)誘導(dǎo)動

17、物：一般選用較大型動物，如犬、家兔，其次大鼠。一般切除90%的胰腺，保留部分胰腺功能。出現(xiàn)多尿、多飲、多食等嚴重糖尿病癥狀。缺點手術(shù)技巧術(shù)后護理,實驗性糖尿病動物模型-飲食誘導(dǎo),飲食誘導(dǎo) 動物：大鼠、小鼠。 高脂高糖飼料喂養(yǎng)。 動物表現(xiàn)為肥胖、糖耐量受損、胰島素抵抗和脂代謝異常。 缺點：造模時間長，4-5個月以上，成本高。,普通飼料,豬油,蔗糖,膽固醇+膽酸鹽,實驗性糖尿病動物模型-飲食誘導(dǎo),,,,,,實驗性糖尿病動物

18、模型-化學(xué)藥物誘導(dǎo),鏈脲佐菌素 (Streptozotocin，STZ)STZ 通過自由基損傷β細胞，使β細胞功能受損,胰島素合成減少,引發(fā)糖尿病。四氧嘧啶( alloxan)四氧嘧啶產(chǎn)生超氧自由基而破壞β細胞，導(dǎo)致胰島素合成減少，胰島素缺乏。其作用可能與干擾鋅的代謝有關(guān)。,實驗性糖尿病動物模型-化學(xué)藥物誘導(dǎo),動物選擇：推薦大鼠170-200g，小鼠17-22g。雄性動物。大鼠推薦用SD，小鼠推薦C57。造模前喂以高脂高糖飼料

19、4-6周，誘發(fā)出胰島素抵抗，再注射小劑量STZ。禁食12h以上（一般過夜禁食，不禁水）。禁食的時間越長，STZ對胰島β細胞的破壞力越明顯。,大、小鼠,腹腔注射 STZ,檢測血糖,動物篩選分組給藥實驗,實驗性糖尿病動物模型-化學(xué)藥物誘導(dǎo),一般癥狀：糖尿病小鼠體重變輕，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，毛豎無光澤，動作遲緩，弓背捲體，尿量顯著增加。,組織病理學(xué)變化正常小鼠：胰島排列呈團索狀，邊緣規(guī)則，數(shù)目多，胰島細胞無壞死，胰島周圍及

20、胰島內(nèi)無炎細胞浸潤。糖尿病小鼠：胰島數(shù)目減少，胰島周圍及胰島內(nèi)出現(xiàn)炎癥。,實驗性糖尿病動物模型-化學(xué)藥物誘導(dǎo),實驗性糖尿病動物模型-聯(lián)合誘導(dǎo),手術(shù)及藥物聯(lián)合制作糖尿病模型,手術(shù)切除實驗動物胰腺鉤突及體尾部，局部應(yīng)用胰腺β細胞毒性藥物，以破壞殘留胰腺的β細胞，造成實驗動物體內(nèi)胰島素缺乏，誘發(fā)實驗動物出現(xiàn)糖尿病的臨床癥象。,克服了全胰切除所致的嚴重創(chuàng)傷和胰腺外分泌障礙的缺點，也避免了大劑量應(yīng)用胰腺β細胞毒性劑給其他組織器官帶來的嚴重損傷。