現(xiàn)代生化技術復習要點2015

1、第一章第一章重組重組DNA技術技術1.寄主的限制和修飾現(xiàn)象：寄主的限制和修飾現(xiàn)象：細菌能將外來的DNA片段某些專一位點上切斷，從而保證其不為外來噬菌體所感染，而其自身的染色體DNA由于被一種特殊的酶所修飾而得以保護，這種現(xiàn)象叫做主的限制和修飾現(xiàn)象2.1限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶Ⅱ類酶特點：類酶特點：識別位點嚴格專一，并在識別位點內將DNA鏈切斷2.2Ⅱ類限制性核酸內切酶命名：類限制性核酸內切酶命名：屬名一個字母（大寫）種名兩個字母

2、（小寫）株名等發(fā)現(xiàn)順序（羅馬字母）2.3限制性核酸內切酶的星號活性：限制性核酸內切酶的星號活性：高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等，會使一些限制性核酸內切酶的切割序列發(fā)生低特異性，這種性質稱為限制性核酸內切酶的星號活性（限制性內切酶在含（限制性內切酶在含50%甘油甘油的緩沖液中，于的緩沖液中，于20℃穩(wěn)定保存）穩(wěn)定保存）2.4部分酶切：部分酶切：部分酶切是指，只對片段上一部分酶切位點產生切割。這種一般是在建庫，或者需要酶

3、切基因組后，獲得一定大小范圍內的片段而使用的酶切方法。這種酶切不要求獲得某一大小的片段，而是要獲得例如200500bp的片段，在電泳上沒有條帶，而是smear。所以部分酶切需要嚴格控制酶的用量和時間，要嘗試稀釋后的酶液，切一定時間段內，哪一個條件可以獲得目標范圍的片段。部分酶切的條件需要更多的摸索，而且重復性要求也會更高。2.5同尾酶：同尾酶：識別位點不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列2.6同裂酶：同裂酶：來源不同，識別序列相同，

4、切割位點可以相同（同序同切酶）也可以不同（同序異切酶），存在位點偏愛現(xiàn)象。3.1甲基化酶：甲基化酶：許多Ⅱ類限制性核酸內切酶都相應存在著相對的甲基化酶，它們可修飾限制性核酸內切酶識別序列中某位堿基甲基化，從而使DNA免受相應的限制性核酸內切酶的切割。用途：就是在必要時可以封閉某一限制性核算內切酶的切口。命名：在對應的限制性內切酶名字前面加M甲基化對限制性核算內切酶的影響：1.修飾酶切位點2.產生新的酶切位點3.23.2T4DNAT4DN

5、A連接酶：連接酶：在實驗中絕大多數情況下使用的是T4DNA連接酶，具有粘性末端和平末端。目前商品化的T4DNA連接酶是由大腸桿菌基因工程菌生產DNADNA連接酶連接酶：借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA中相鄰的3’OH和5’P之間形成的磷酸二酯鍵3.33.3S1S1核酸酶：核酸酶：來源于米曲霉菌，其特征如下：1.降解單鏈DNARNA，降解DNA的速度大于降解RNA的速度2.降解發(fā)生的方式為內切和外切，產生帶5’磷酸的單核苷酸或寡

6、核苷酸3.酶切活性需要pH4.04.5的酸性環(huán)境，且為Zn2所激活4.酶量小時僅切割帶缺口或缺刻的雙鏈DNA5.酶量過大時會降解雙鏈核酸，因為雙鏈降解活性比單鏈低7.5萬倍S1核酸酶常用來切平突出的單戀末端3.43.4DNADNA聚合酶聚合酶Ⅰ：5’3’聚合酶活性——聚合作用3’5’外切酶活性——校對作用5’3’外切酶活性——切除修復作用（切口平移）KlenowKlenow酶：酶：是大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的氨基大片段，沒有5’3’外切酶

7、活性，基因工程中常用該酶填平5’突出的粘性末端進入細胞后，完全依靠質粒上的復制子進行復制攜帶質粒的選擇標記，便于篩選含有多種單一酶切位點，便于克隆8.DNA8.DNA片段的連接片段的連接定向克?。煌庠碊NA片段定向插入載體分子粘性末端：（不同粘性末端的連接）1.突出末端相同（5’突出）：用Klenow酶補平或S1核酸酶切平，之后再用T4DNA連接酶連接2.突出末端相同（3’突出）：用T4DNA聚合酶切平，之后再用T4DNA連接酶連接。3

8、.突出末端不同：用Klenow酶補平或S1核酸酶切平，之后再用T4DNA連接酶連接平末端：屬于分子內的連接，反應速度要比粘性末端的連接慢得多添加同聚尾末端方向：用Klenow補平或者用同聚結尾法都是從5’3’，切5’突出用S1核酸酶，切3’突出用T4DNA聚合酶9.9.提高重組率的方法：提高重組率的方法：（1）提高外源DNA片段與載體的分子比（2）載體分子在連接前先除磷（3）用TdT加裝人工粘性末端10.110.1轉化子：轉化子：將質粒

9、為載體構建的重組DNA導入受體細胞的過程稱為轉化。轉化后的受體菌，稱轉化子10.210.2重組子：重組子：含有重組DNA分子的轉化細胞10.310.3轉化率轉化率：產生菌落的總數DNA的加入量。定義：每微克載體DNA在最佳轉化條件下進入受體細胞的分子數11.11.感受態(tài)細胞：感受態(tài)細胞：受體細胞處于攝入外源DNA的狀態(tài)12.112.1轉化轉化：將質粒為載體構建的重組DNA導入受體細胞的過程12.212.2轉染：轉染：將噬菌體（病毒）DN

10、A導入受體細胞的過程12.312.3轉導：轉導：以噬菌體顆粒為媒介轉移DNA的過程13.113.1抗菌性篩選法（抗菌性篩選法（exex環(huán)絲氨酸篩選）環(huán)絲氨酸篩選）最常見的載體攜帶的標志是抗藥性標志，如抗氨芐青霉素（Ampr）、抗四環(huán)素（Tetr）、抗卡那霉素（kanr）等當培養(yǎng)基中含有抗生素是，只有攜帶相應抗藥性基因載體的細胞才能生存繁殖如果外源目的序列是插入在載體的抗藥性基因中間使這抗藥性基因失活，這個抗藥性標志就會消失13.213.