一種基于Bn-Km抗性的微紫青霉菌菌株GXCR的插入誘變載體的構建.pdf

1、目前，重金屬污染已成為環(huán)境中的重要污染物之一，也是全世界普遍關注的環(huán)境問題。絲狀真菌具有堅硬的幾丁質細胞壁、孢子繁殖、基因組相對較小等形態(tài)學和生理學特征成為重金屬污染的生物修復的理想對象。闡明絲狀真菌重金屬的抗性機制研究其基因功能顯得尤為重要，而研究基因功能最直接簡便的方法是反向遺傳學法，它是通過遺傳轉化的方法構建覆蓋整個基因組的突變體庫，根據(jù)突所造成的表型分析從而確定基因的功能。近年來在真菌中發(fā)展的根癌農桿菌介導的遺傳轉化具有高效、穩(wěn)

2、定、高頻單拷貝隨機插入、適用范圍廣、成本低、操作方便和重復性好等特點，成為當前研究絲狀真菌基因功能的主要工具之一。
　　 本實驗室曾分離得到一株高抗多種重金屬鹽且對苯菌靈敏感的微紫青霉菌（Penicillium janthinellum）菌株GXCR，本研究在質粒pG-Bn（本實驗室構建的T-DNA區(qū)已插入苯菌靈抗性基因的載體）的基礎上在其T-DNA區(qū)再插入卡那霉素抗性基因，構建插入誘變載體命名為pG-Bn-Km，再由根癌農桿菌

3、LBA4404介導產生GXCR菌株的插入突變體。從乙酰丁香酮（AS）的濃度、共培養(yǎng)的時間、共培養(yǎng)的溫度、受體菌孢子的濃度、農桿菌的濃度、共培養(yǎng)的pH值6個因素設計正交實驗，求解該菌的最優(yōu)轉化條件，為今后通過插入誘變大規(guī)模鑒定該菌的的基因功能奠定基礎。其轉化的最適條件為AS濃度100μmol/L、農桿菌OD600=0.45、GXCR孢子濃度106個/ml、共培養(yǎng)溫度32℃、共培養(yǎng)的pH=5.4、共培養(yǎng)60 hr，在此條件下，平均每106個