干細胞技術服務

1、,干細胞產(chǎn)品技術服務,,,,OricellTM,OricellTM,,,,最新產(chǎn)品：,1. ES成神經(jīng)元分化試劑盒；2. ES成心肌分化試劑盒；,3. ES成肝實質(zhì)細胞分化試劑盒；4. MSC成肝實質(zhì)細胞分化試劑盒；5. NSC成神經(jīng)元分化試劑盒；,6. NSC成星型膠質(zhì)細胞分化試劑盒；,目錄：,胚胎干細胞培養(yǎng)和技術介紹,成體干細胞的常見問題與解決方案,1.細胞和培養(yǎng)（干細胞、原代細胞產(chǎn)品和試劑）2.細胞分化（多個方向的標準方法

2、）3.細胞示蹤（GFP/RFP 和定制方法）,干細胞凍存和復蘇方案干細胞應用技術,,,,Stem cell,間充質(zhì)干細胞（MSC）,Mesenchymal Stem Cells是一種多能干細,胞；,胚胎干細胞（ES）,Embryonic Stem Cells是一種全能的干細,胞,神經(jīng)干細胞（NSC）,Neural Stem cell是一種神經(jīng)系統(tǒng)的多能干,細胞,,,,Primary cell,神經(jīng)元系統(tǒng)（多個來源和物種，海馬、皮層

3、）星型膠質(zhì)細胞（多個物種皮層）肝實質(zhì)細胞；,肝臟前體細胞；,分離其他客戶定制細胞；,,,,胚胎干細胞,,,,胚胎干細胞,胚胎干細胞(embryonicstemcellES, 細胞)是指胚泡期的內(nèi)細胞團中分離出的尚未分化的、能在體外培養(yǎng)、具有發(fā)育全能性的早期胚胎細胞無限增殖、自我更新,可分化為三個胚層來源的各種組織及細胞類型,ES細胞的來源：5d 胚胎,ABC D,,,,,ES生長特性,鼠：生長快，胰酶消化，2天傳一次

4、，可一傳多。,復蘇率較高。,人：生長慢，機械分離，7~10天傳一次，相,對較少。1:4~1:6。,復蘇率低。,,,,,,,表面抗原的表達,Oct-4：一種轉錄因子，發(fā)育全能性的標志。,堿性磷酸酶（AKP）：常被用來作為鑒定ES,細胞及其分化與否的重要標志。,SSEA-1：小鼠ES表達,SSEA-3、SSEA-4：人ES表達,,,,染色體結構,核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。,46，XX；46，XY,,,核型檢測：

5、46，XX,多能性和全能性體內(nèi)：畸胎瘤實驗特定抗,擬胚體,特定條件誘 體免疫導/自然分化 組化,體外分化,去除飼養(yǎng)層細胞,,,,,全能性,體內(nèi)：畸胎瘤實驗,體外：去除飼養(yǎng)層細胞,擬胚體（EB, embryoid body。為ES 細胞懸浮,生長自發(fā)分化形成,含有內(nèi)中外三個胚層組織,能基本上模擬體內(nèi)的發(fā)育過程) ；貼壁誘導；,特定條件誘導/自然分化（除去LIF）各胚層特定抗體免疫組化

6、檢測,體內(nèi)：畸胎瘤檢測,血管組織呼吸道上皮,鱗狀上皮,腺體組織脂肪組織,,,,體內(nèi)分化,外胚層：鱗狀上皮、神經(jīng)組織等,中胚層：骨和軟骨、橫紋肌、骨骼肌、血細胞和骨髓細胞等內(nèi)胚層：柱狀上皮、腸管樣組織等,,,,體外：分化形態(tài),ES貼壁誘導,EB約5~7天后出現(xiàn)自主性搏動,,129 Mouse,Human ES,,,,免疫組化

7、檢測,Nestin (ectoderm )Troponin (mesoderm ),Tubulin (ectoderm )AFP (endoderm),,,,神經(jīng)分化：貼壁誘導第2天,神經(jīng)分化：貼壁誘導第5天,,,,IHC β‐3 Tublin,特異性抗原的表達情況,抗原人ES鼠ES,Oct-4++,Nano

8、g++,SSEA-1ˉ+,SSEA-3+ˉ,SSEA-4+ˉ,不斷有新的蛋白標記被發(fā)現(xiàn)和論證,,,,堿性磷酸酶染色,,,,小鼠ES流式圖,,,,染色體結構,核型分析：正常穩(wěn)定的二倍體核型。不隨傳代次數(shù)而改變。,人（46，XX），鼠（40，XY),,,,性別分析,性別通過PCR的方法鑒定，目的基因是基因組,DNA的Y染色體相關基因Tspy，陽性對照用X,染色體相關基因PolA1以及G

9、apdh 。,,ES Clone,mES-GFP,HumanES-GFP,,,,MEF 細胞：ES成功的一個重要因素,Cyagen提供的MEF經(jīng)過γ-irradiation 處理，,確保所有的細胞都完全失去增殖能力，又可以保證最佳支持和分泌能力，同時沒有任何化學有毒物質(zhì)的污染，為你ES細胞提供最佳的生長環(huán)境；為ES的增殖提供多種因子；,,,,實驗室的調(diào)查普遍結果：,據(jù)Cyagen 對多個實驗室使用的53個ES細胞,的樣品進行檢

10、測，45%被支原體污染；,沒有嚴格質(zhì)量控制和環(huán)境控制的情況下制作的,MEF：有35%以上是攜帶支原體，這個數(shù)據(jù),還根據(jù)操作技術不成熟，使用動物污染嚴重情況，風險也會大大的增加；,,,,絲裂霉素‐C（MITOMYCIN C）：,A、長期接觸絲裂霉素‐C，藥物毒性將嚴重影響操作人員的身體健康；（單位量10‐30ug/ml處理20個10cm dish需要3‐6mg）,B、絲裂霉素‐C溶液的不穩(wěn)定，4℃保存，也會快速降

11、解，導致處理的細胞不能完全失活，這將嚴重影響后面實驗分析；,C、絲裂霉素‐C的殘留，微量的絲裂霉素‐C也會造成ES細胞增殖抑制和分化；（因為其是細胞內(nèi)DNA結合劑）,,,,,OCT-4 (+)SSEA-1 (-)SSEA-4 (+),AAA,BBB,C

12、CC,,,,Es細胞培養(yǎng)的過程：,如何準備狀態(tài)良好的MEF細胞；消化傳代過程；,如何去除MEF細胞；挑克隆的操作；,如何準備用于進行各種基因操作的細胞；如何準備用于進行注射的細胞；,,,,如何準備狀態(tài)良好的MEF細胞；,取胚胎（13.5d）：去除頭部和四肢；,剪碎后加入0.125%胰酶進行消化到組織塊基本消失；,終止消化并離心收集細胞；（檢測細胞支原體）重懸接種：5000-10000c

13、ells/cm2第二天換液后培養(yǎng)3天，進行γ-射線照射；凍存檢測；,,,,生產(chǎn)過程控制：,動物：胚胎的孕齡；動物的污染物；細胞的支原體；,細胞的支持能力；細胞的失活；,蛋白表達檢測；,,,,合適的MEF的密度：,細胞的貼壁效率；細胞的分泌能力；細胞的大??；,,,,最佳的密度受到很多因素影響：25000cells,過密：克隆生長緩慢，克隆小，但是立體感好；過?。嚎寺∪菀追只吘壊磺逦?，但是克隆增殖稍快；

14、,最佳的密度：克隆邊緣清晰，細胞容易增殖，大小均一。,,,,如何去除MEF：,無飼養(yǎng)層培養(yǎng)：但是代數(shù)非常有限，基本不能長期傳代；,MEF培養(yǎng)：可以長期培養(yǎng)，細胞的狀態(tài)好，不,影響細胞的全能性；,原理：利用不同細胞的貼壁的時間差異；,步驟：消化后離心重懸，在包被明膠的皿上貼壁,30min，輕輕吸出上清，接入另外一個包被有,明膠的皿中30min，再吸出上清中的細胞；并在包被的皿上培養(yǎng)一段時間，就可以去除大部分的MEF細胞；,,,,影

15、響因素：,克隆的狀態(tài)：分化的細胞的貼壁性會大大增加；,MEF的狀態(tài)：MEF如果有大量的碎片也會增加,液體的粘稠度干擾細胞的正常分離；,消化的效果：如果有MEF沒有和ES很好的分開，會將ES一起貼在皿上；,細胞團和顆粒：顆粒大細胞團會導致細胞快速沉淀并導致細胞貼壁；,如果效果不佳可以進行多次的重復，但是會大大減少細胞的回收率；,,,,ES細胞的傳代：,細胞的克隆出現(xiàn)足夠大，細胞的邊緣開始出現(xiàn)不清晰，細胞的克隆出現(xiàn)部分分化的情況；一

16、般的周期是3-5天；,傳代比例依據(jù)細胞的克隆大小和細胞的生長狀態(tài)，比例為1：5-1：10；,消化的時候觀察一般以MEF為標準，如果MEF基本上已經(jīng)開始脫壁就可以終止消化；,,,,?,?,?,?,?,挑克隆技術：,當克隆大部分出現(xiàn)分化的時候；克隆大小不均并且生長緩慢；注意事項：,拉針（要注意末端的大小）或使用1ml的注射器；,在體視鏡下操作，要在解剖超凈臺中操作；注意環(huán)境，避免污染；,提取的克隆要消化后才能進行接種；

17、單克隆的培養(yǎng)周期長，要更有耐心；,,,,用于ES囊胚注射的細胞控制：,低代數(shù)：（細胞的全能型和基因變異和染色體變異）,低分化程度：（細胞分化會大大影響細胞最后的整合的效率和生殖遺傳的比例）,最低的控制標準：正常的核型，細胞的各種分化蛋白沒有表達，各種ES的正常表達蛋白正常；具有成瘤性；增殖速度快；無任何外源污染；,,,,其他類型的成體干細胞,間充質(zhì)干細胞神經(jīng)干細胞,,,,,,間質(zhì)干細胞是目前研究最多的干細胞,來源研究方向：

18、不斷有文章報道從不同的組織分離出MSC，整體方向是有利臨床廣泛取材和減少病人痛苦；,與組織工程結合的研究方式，最重要是如何提高與組織的相容性和提高在向多個方向分化的控制，如何成為一個真正的組織；,臨床治療研究，也是目前細胞治療的研究熱點，國內(nèi)主要的治療細胞；,基因研究的載體，干細胞分化機制模型；,,,,Cyagen能夠提供協(xié)助：,來源研究：基本上從體內(nèi)的各個組織中發(fā)現(xiàn)非常多的干細胞，包括肌肉，肺部，肌腱，血管，皮膚等，而這

19、些細胞都具有含量非常少，同時也具有非常明顯的組織特意性，表達非常多的組織特異性的蛋白；（提供高難度提取服務）,組織材料學：結合納米材料和其他生物學材料，用于研究具有臨床前景的材料；（細胞相容性，蛋白表達，細胞分化分析等）,臨床研究：如何從單一來源獲得大量穩(wěn)定而且維持良好的生物學特性的細胞，同時保證生物的安全性；（提高全套的技術支持和服務）,,,,間質(zhì)干細胞,定義：來源于中胚層的早期細胞， 能夠分化為多種中胚層和神經(jīng)外胚層來

20、源的細胞。,來源組織：骨髓、骨膜、脂肪組織、臍血等。來源物種：人、大鼠、小鼠、猴子、犬、兔子、豬等。,,,,分離方法,骨髓,人，猴子，犬,密度梯度離心法：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。,大鼠，小鼠，兔子：全骨髓貼壁法,脂肪等組織：,人、大鼠、小鼠： 酶消化法,,,,,,,鑒定方法不同物種的表面標記差異：,表面標志人 ,猴子

21、大鼠小鼠,陽性CD29,CD44,CD71,CD90CD29,CD44,CD105CD29,CD44 ，CD166,陰性CD34,CD45,CD105,CD166CD34,CD45弱陽:CD34，CD45,,,,傳代能力,有限增殖，隨著傳代次數(shù)增加，分化能力逐漸降低，按照1：2的比例：,人：1~2代達到純化，最多15~20代。,大鼠：3~4代達到純化，最多20~25代。,小鼠：

22、7~8代達到純化，最多25~30代。,,,,間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)的問題/解決方案,? BMSCs：來源長骨的骨髓，體內(nèi)與造血功能有緊密關系，,但是也存在牙髓和其他短骨里面，缺點是取材時給病人的痛苦較多；,? ADSCs：來源全身的脂肪組織，包括皮下和內(nèi)臟脂肪墊；,來源屬于微創(chuàng)方法取材，主要是來源于抽脂減肥的手術；,? 其他來源的間質(zhì)干細胞：胰腺干細胞、心臟干細胞、肝臟干細胞、肌腱干細胞和牙周膜干細胞等；還有新生兒的臍帶、胎盤

23、等其他組織；,,,,? 細胞形態(tài)：不同的組織來源的間質(zhì)干細胞的形態(tài)多樣，,基本無法從細胞的形態(tài)上進行有效的區(qū)分；,? 表面抗原：不同來源的細胞的表面標記會有差異BMSC和ADSCs的區(qū)別就是CD106（+/-）和CD49d（-,/+）；,? 分化能力：會有較大的波動，隨著不同個體、不同組織,來源會有變化；,? 培養(yǎng)液選擇：不同來源也是不同！,,,,,間質(zhì)干細胞形態(tài)特征,P0,40X,P3,40X,,,,骨髓間質(zhì)干細胞定向分化

24、為脂肪細胞,,,,,梭形、纖維樣細胞原代：克隆樣生長傳代后：勻質(zhì)、渦旋狀排列,HumanDog,RatMonkey,MouseRabbit,,,,間質(zhì)干細胞培養(yǎng)系統(tǒng),標準：,1.增殖速度變化；2.細胞分化影響；3.形態(tài)學變化；,4.克隆形成率變化；5.基因表達影響；,6.使用的特殊要求；7.價格因素；,,,,如何選擇間質(zhì)干細

25、胞培養(yǎng)系統(tǒng)？,? 基礎培養(yǎng)基的選擇:依據(jù)細胞的生長和要求參照文,章進行優(yōu)化，需要添加部分的氨基酸或者糖；,? 血清篩選：應該利用10株以上的細胞，進行克隆,形成率、生長曲線、分化能力的比較；,? 添加物：營養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)、抗生素、細胞,因子添加；,優(yōu)選專業(yè)血清,普通胎牛血清,普通牛血,清,,,,,,細胞培養(yǎng)過程常見問題,細胞增殖速度下降：間質(zhì)干細胞不是無限的細胞系，最佳的實驗窗口是P3-P8；,細胞老化：培養(yǎng)環(huán)境不

26、適合（包括培養(yǎng)的表面和培養(yǎng)液）；胰酶對細胞表面蛋白的傷害；缺乏相關的生長因子；細胞本身端粒影響；,細胞分化：血清中激素影響、培養(yǎng)表面影響、體外培養(yǎng)時間影響；,,,,間質(zhì)干細胞常見的污染和控制,細胞污染、造血系統(tǒng)細胞；,取材來源污染：病毒、或者其他感染；,支原體污染：隱性污染，一般難以察覺，導致細胞狀態(tài)不斷下降，影響細胞正常增殖，擴散和污染環(huán)境，影響最大；,,,,神經(jīng)干細胞,廣泛存在于成年或胚胎哺乳動物大腦內(nèi),可分化為神經(jīng)元、星

27、形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞。,,,,神經(jīng)干細胞,,,,神經(jīng)干細胞生物學特性,Nestin陽性,自動聚集成球，球體的表面存在絨毛懸浮生長,無血清培養(yǎng)，血清替代物，bFGF，EGF,,,,神經(jīng)干細胞,,,,NSC存在神經(jīng)系統(tǒng)中的干細胞,分化：神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等,,,,NSC取材和培養(yǎng),鼠神經(jīng)干細胞（NSC）：來源于14.5d胚胎的大腦GE區(qū)；,,,大鼠神經(jīng)干細胞-懸浮培養(yǎng)

28、小鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng),大鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細胞-貼壁培養(yǎng),,,,使用Cyagen 神經(jīng)干分化試劑,使用血清誘導,,,,NSC的操作要點：,傳代培養(yǎng)：,1、懸浮培養(yǎng)必須控制球的大小，傳代時,自然沉降，去除其中大球；可以使用機械的方法；,2、懸浮法培養(yǎng)可以獲得大量的細胞；,3、貼壁法培養(yǎng)細胞可以用于轉基因操作，,但是費用很高；,4、整個培養(yǎng)過程必須保證無血清；5、保

29、證細胞純度，獲得高擴增率；,,,,干細胞的分化機理和相關的技術產(chǎn)品,,,,干細胞分化機理,Wildtype,mouse,fibroblasts,Mouse,Fibroblasts,Carrying,Myf5 BAC,,,,干細胞分化能力鑒定,分化試劑（檢測干細胞的尺）：必須穩(wěn)定，否則結,果波動非常大，將無法分析；,每次配置的分化試劑：必須是有陽性對照進行檢測，保證有分化誘導能力再用于檢測其他的細胞；不同的物種間最佳的誘導物濃度不同

30、，所以不同物種間最好做一下濃度上面的優(yōu)化；,,,,,,,,,,干細胞分化的常見問題,分化比例影響因素；,? 細胞群分化能力：整個細胞群體中干細胞的比率決定；? 代數(shù)：細胞的分化比率隨代數(shù)增加下降；,? 誘導系統(tǒng)穩(wěn)定性：誘導組方、藥物效價和配置過程影響；,,,,,,,分化時間影響因素,成骨：2-4周成脂：2-4周,成軟骨：3-4周,不同物種：人和大鼠容易誘導，小鼠的需要更長時間，狗和兔子誘導時間波動大；,動物大小影響：人和

31、靈長類、狗等胚胎期或者新生代幼體分化率偏低；而成體的來源的MSC分化能力高！,臍帶、臍血的MSC分化比例較低。,細胞質(zhì)量影響才是影響分化關鍵的核心！,,,,分化的影響因素,不同的物種：波動很大，不能橫向比較；,不同提取方法：操作方法的差異，導致細胞群組成差異；,不同的培養(yǎng)系統(tǒng)：影響細胞的形態(tài)、大小、克隆的形態(tài)也不同，分化能力也有差異；使用a-,MEM會降低干細胞的成脂肪分化；,不同代數(shù)：分化也是會有波動，同時各個方向的分化變化

32、的速度不同步；,,,,Cyagen提供完善的分化系統(tǒng),骨、脂肪、軟骨分化：囊括了多個物種、多種來源的干細胞的分化的試劑；穩(wěn)定高效：干細胞的金指標；心肌分化、神經(jīng)分化,OricellTM提供定制的分化服務；,,,,干細胞大規(guī)模培養(yǎng)解決方案,應用的方向；,? 大動物的體內(nèi)實驗：包括靈長類 等，需要的細胞量都是,108這個數(shù)量級以上；,? 多組動物的實驗：要獲得更加有說服力結果；? 大規(guī)模的篩選：中藥成分篩選、藥物單體實驗；

33、? 臨床使用干細胞：干細胞的最終應用；,OricellTM 提供大規(guī)模細胞培養(yǎng)服務,,,,OricellTM大規(guī)模培養(yǎng)的實現(xiàn),使用T175培養(yǎng)：數(shù)量上可以直接增加，但是增加污染的風險，系統(tǒng)不穩(wěn)定；,使用多層培養(yǎng)瓶、轉瓶；,使用小型細胞培養(yǎng)罐：細胞擴增容易但是收獲困難，條件控制不成,熟；,密閉的細胞工廠系統(tǒng)：全密閉系統(tǒng)，可以用增加數(shù)量方法放大規(guī)模，但是成本較高，需要環(huán)境控制系統(tǒng)；,,,,,?,?,?,?,干細胞質(zhì)量控制和解決方

34、案；,表面標記與細胞分化：,表面標記有哪些核心標記：現(xiàn)在目前并未有一個非常特異得到公認的表面抗原分子；,Cyagen研究發(fā)現(xiàn)，表面抗原分子和分化不具有,穩(wěn)定相關性；,表面抗原變化主要集中在前期和高代數(shù)時變化；分化能力的變化主要和代數(shù)有關，和表面標記有半相關性；,,,干細胞增殖能力指標；,? 生長曲線：表現(xiàn)細胞自我更新能力的一個指標；? 克隆形成率：表示具有較強自我更新能力的細胞,的比例的指標；,屬于和干細胞“Self-R

35、enew”相關；,,,,?,?,?,?,?,體內(nèi)實驗使用細胞污染物控制,細胞污染物的控制和檢測方法；,細胞間污染：不能不同細胞一起操作，使用相同的一瓶試劑；操作最好間隔1個小時；,細菌污染：所有使用的培養(yǎng)試劑進行無菌檢測；,真菌污染：嚴重影響細胞體內(nèi)試驗，一旦出現(xiàn)極難處理；內(nèi)毒素：對所有使用的器械、容器、管道都進行處理，,250度干烤或者是用堿洗；,外源異物污染：避免使用玻璃操作，使用有認證的產(chǎn)品，個人防護；同時使用前對細胞懸液

36、中進行觀察，看是否有顆粒；,,,,大規(guī)模和有穩(wěn)定質(zhì)量控制的細胞的應用,動物的體內(nèi)試驗和解決方案,,,,干細胞的動物體內(nèi)實驗,,,,?,?,?,?,干細胞體內(nèi)應用的注意事項,凍存的細胞是否可以復蘇直接用于實驗；理論上是可行，但是對凍存液要求很高；復蘇率達到90%以上，減低死亡細胞影響；,MSC類的細胞普通凍存液復蘇后細胞非常的脆,弱，最好經(jīng)過一次的培養(yǎng)；,需要清洗：去血清和DMSO（2.5-11g/kg），同時降低內(nèi)毒素；,O

37、ricell TM NCR凍存液、DMSO-Free凍存液,,,,細胞自然成團對體內(nèi)實驗的影響,導致血管內(nèi)出現(xiàn)細胞栓塞，直接導致動物急性死亡；,會在肺部、肝積聚，減低器臟功能，長期會有纖維化風險；,細胞在懸浮的狀態(tài)下，會自然的聚集成松散團；死細胞多，釋放的DNA會導致細胞聚成大團；,1. 一小時內(nèi)使用：,2. 細胞充分吹勻或者使用濾網(wǎng)：200-250目3. 培養(yǎng)過程中細胞絕對不能過密：80%最佳4. 細胞代數(shù)不能太高<

38、P5,,,,體內(nèi)試驗的實現(xiàn)方法：,注射的方法和溶劑；,局部注射：肌肉、肝、中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)；全身注射：鼠尾靜脈、兔子耳緣靜脈等；溶劑：培養(yǎng)液、PBS、HBSS、生理鹽水；污染物的控制；（內(nèi)毒素、熱源、真菌污染、外源物質(zhì)污染的影響）,,,,體內(nèi)研究：示蹤作用,GFP/RFP干細胞研究中重要作用,干細胞移植后在體內(nèi)的生物學變化（如遷移、分布、增殖、分化等）都離不開對植入干細胞的示蹤和定量技術。,GFP或RFP由于檢測方便、表

39、達穩(wěn)定和不影響細,胞功能等特點，目前在干細胞的移植研究中GFP或RFP的重要性越來越得到重視。,,,,GFP、RFP標記,綠色熒光蛋白（GFP）紅色熒光蛋白（RFP）,擬人化綠色熒光蛋白（hrGFP）,,,,GFP、RFP標記的優(yōu)點,檢測方便：不需要底物或輔因子,可對活體檢測,因而可對被標記對象進行動態(tài)、連續(xù)的觀察。熒光穩(wěn)定，不易淬滅，尤其是hrGFP對細胞的毒性較小,,GFP標記的人胚胎干細胞,,GFP/RFP

40、標記的小鼠胚胎干細胞,,,,GFP標記的間質(zhì)干細胞,成人間質(zhì)干細胞,胎兒間質(zhì)干細胞食蟹猴間質(zhì)干細胞,,,F344大鼠間質(zhì)干細胞,SD大鼠間質(zhì)干細胞,Wistar大鼠間質(zhì)干細胞,,,,神經(jīng)干細胞,人神經(jīng)干細胞,小鼠神經(jīng)干細胞,GFP標記的小鼠神經(jīng)干細胞,,干細胞應用研究,賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司,,,,干細胞研究為什么引起這么大的重視,肌萎縮側索硬化病 (ALS),Alzheimer’s Dis

41、ease,,,,造血干細胞移植,我國白血病的年發(fā)病率為4/10萬人，每年新增約4萬名白血病患者, 其中約2萬名是兒童。我國長江流域以南的兩廣和云貴地區(qū)的地中海貧血的發(fā)病率高達10%以上,廣東省每年新增重度,beta-地貧患兒400名。,一些重度自身免疫性疾病,如紅斑狼瘡,多器官硬化等發(fā)病率更高。,,,,造血干細胞移植存在的問題,移植后造血恢復緩慢,移植物抗宿主病(graft-versus-host,disease, GVHD)

42、是骨髓移植(BMT)后出現(xiàn)的,多系統(tǒng)損害(皮膚、食管、胃腸、肝臟等)的全身性疾病，是造成死亡的重要原因之一。,,,,間質(zhì)干細胞的臨床應用,促進造血和免疫功能重建治療GVHD,心腦血管疾病免疫系統(tǒng)疾病,,,,間質(zhì)干細胞（MSC）的優(yōu)點,間質(zhì)干細胞在骨髓中就是造血干細胞的支持細胞,MSC的低免疫原性,MSC的免疫調(diào)節(jié)作用，降低免疫應答MSC誘導免疫耐受,MSC表達多種趨化因子受體，體內(nèi)可趨化遷移,到受損組織和器官,,,,間質(zhì)干

43、細胞促進造血恢復和免疫重建，降低GVHD,前期動物試驗顯示:,1. MSC促進受體鼠的外周血白細胞、血小板、淋,巴細胞的明顯恢復；,2. 幫助胸腺、脾臟的結構重建，加速T細胞恢復3. 降低GVHD的發(fā)生率及嚴重程度,,,,MSC治療慢性GVHD的臨床試用MSC治療難治性cGVHD的臨床試用治療慢性GVHD病人10例，其中7例病人的口腔潰瘍、皮疹、肝功能異常、關節(jié)酸痛等癥狀有明顯好轉。MSCs輸

44、注量:,異體MSCs數(shù)自體MSCs數(shù)臍血輸注量：有核細胞CD34+細胞,4×106/kg8×106/kg6 ×107/kg5×105/kg,,,,MSC輸注對移植物抗宿主病的療效,,,,間質(zhì)干細胞的其他臨床應用,缺血性心臟病，如心肌梗死,缺血性腦病，如腦梗死，缺血缺氧性腦病肝臟疾病，如肝纖維化腎臟疾病，如急性腎衰,,,,組織工程應用,

45、納米材料：,成骨誘導，表面結合DEX-Vc,,,與納米材料結合軟骨細胞,,,,組織工程存在的問題,細胞和材料的相容性問題細胞對材料表面的要求材料的生物安全性,細胞來源安全性問題組織生長的調(diào)控,細胞在材料內(nèi)部的功能性恢復,臨床使用上面的相容性問題,,,,良好的生物材料的要求,1、生物相容性：組成和結構與人體相應組織相,似，無免疫排異原性，良好生物相容性及組織相容性，能與宿主組織愈合，誘導再生性修復。,2、生物力學順應性：

46、滿足應用場合的生物力學,要求。,3、生物降解性：能按需要降解，做到隨再生組,織的生長而作順應性降解，使組織的生長與材料降解同步。,4、材料表面或者材質(zhì)能夠植入后，在原位誘導,組織再生。,,,,骨組織相容性的檢測,,,,神經(jīng)干細胞的臨床應用,脊髓損傷,缺血性腦卒中,神經(jīng)元退行性病變，如ALS、帕金森病等,,,,胚胎干細胞的臨床應用,無限增殖、多向分化潛能,目前還存在較多的問題，主要是在動物實驗階段。目前關于胚胎干細胞治療相關動物模

47、型的實驗研究較多，如帕金森病等。,,,,胚胎干細胞其他應用,建立胚胎干細胞的體外分化模型,建立各種基因改變的胚胎干細胞系, 以求發(fā)現(xiàn)某些基因或細胞因子在胚胎發(fā)育早期對不同類型細胞或組織分化的作用。,,利用新生（Postnatal,day 0）Nestin-GFP轉基因小鼠研究證明多個臟器Nestin表達陽性,,,,Sperm development defect of CDYL homozygotes F,,,,藥物篩選的

48、平臺,新藥在臨床使用前需要進行一系列的檢測和實驗,這些實驗都依靠動物來完成。,但是動物模型實驗不可能完全反映藥物對人體細胞的作用。,胚胎干細胞能模擬體內(nèi)細胞或組織對被檢測藥物的反應, 從而提供更安全、更有效、更經(jīng)濟的藥物篩選模型。,,干細胞凍存復蘇方案,賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司,,,,干細胞的凍存原理,在不加任何保護劑條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變

49、、脫水、pH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。,如向培養(yǎng)液中加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。,細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的-,5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。,干細胞凍存液的選擇,選擇一種省時高效、安全穩(wěn)定的凍存液，,是做好細胞凍存的關鍵！,,,,什么是NCR凍存液？,Non-Control Rate NCR,無控制

50、速率,就是降溫過程無需控制,,,,OriCellTM NCR凍存液研發(fā)機理,高山植物復活草耐過冰雪嚴寒仍能復活，某些昆蟲在高寒條件下可以不凍死；都是因為其自身含有一些保護物質(zhì)，能在極端環(huán)境下保護細胞不受損傷。,,,,OriCellTM NCR凍存液的研發(fā)機理,Cyagen團隊模擬自然界這種神奇的自我保護能,力，在凍存液里添加了多種抗寒膜外保護劑、滲透性保護劑及沉降穩(wěn)定劑，使細胞在低溫環(huán)境下得到很好的保護。,,,,OriCell

51、TM NCR凍存液的作用機理,細胞膜保護劑---可在細胞膜外瞬間形成一層保護膜，保護細胞不受細胞外冰晶的損害。,滲透性保護劑---可迅速滲透至細胞內(nèi)部，防止細胞內(nèi)部產(chǎn)生大量冰晶，同時可保護細胞器，減少其在低溫下的損傷。,細胞沉降穩(wěn)定劑---可平衡細胞沉降速度，防止細胞在凍存過程中聚集成團。,,,,Oricell,TM,NCR-Cryopreservation medium,Oricell TM NCR-Cryopreser

52、vation10% DMSO inFBSControlNomal Cryo,,,,細胞復蘇率%,OricellTM NCR-Cryopreservation mediumNCR-Cryopreservation Medium10095908580757065605550,C57B

53、L/6,Balb/C,Wistar SD Rat,F344,Rabbit,Canine,Monkey C57BL/6,129,ICR MEF,MouseMSC,MouseMSC,Rat MSC,MSC,Rat MSC,MSC,MSC,MSC,MouseEsc,MouseEsc,細胞種類,,,,傳統(tǒng)細胞凍存液,大部分實驗室會自制凍存液來凍存干細胞；,其缺點在于：,是需花大量資金購買程序凍存儀器，或花上半天的時間去等待

54、細胞的程序降溫。,自制凍存液質(zhì)量不穩(wěn)定，批次間差異較大，容易造成細胞復蘇率低和實驗的不可對比性。,新手未掌握凍存時間，在環(huán)境轉移過程中容易造成溫度波動而損害細胞。,,,,Cyagen的無程序凍存液,無需程序降溫，-80℃一步凍存、無血清、無任何蛋白；高復蘇率>90%,不影響干細胞的特性；細胞增殖不改變、細胞,分化不改變；,容易使用、穩(wěn)定性高,可以直接使用，無需任何的操作,凍存過程中細胞環(huán)境穩(wěn)定，無溫度波動,干細胞的凍存

55、,凍存流程：,1、選擇處于對數(shù)生長期的細胞，按照常用的方法收集細胞于試管中，計算細胞數(shù)量。,2、離心收集的細胞（參考離心條件：4℃，250g，3-5分鐘），吸去上清液。,3、加入適當?shù)膬龃嬉旱诫x心管，緩慢混合均勻，制成細,胞混合液。細胞凍存濃度約為105～106Cells/ml。,4、將離心管中的細胞混合液分裝至已做標識的凍存管。5、將分裝好細胞的凍存管直接放于-80℃冰箱，24h后可以移入-196℃液氮中長期保存。,,,,干

56、細胞的復蘇,復蘇流程：,1、準備好相應的細胞培養(yǎng)液，平衡至室溫；往離心管中加入6-8mL細胞培養(yǎng)液。準備37℃水浴。,2、從-80℃冰箱或液氮取出凍存的細胞，迅速放入37℃水浴中快速晃動，待凍存懸液完全溶解后，往凍存管中加入1mL細胞培養(yǎng)液，稍微吹打后立即將細胞混合液移入裝有細胞培養(yǎng)液的離心管中，混合均勻。,3、離心收集的細胞（離心條件可參考細胞凍存方法），盡量移去上清液。,4、加入細胞培養(yǎng)液重懸細胞，制成細胞懸液，按各自實