黏紅酵母產(chǎn)油脂培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

1、2013年2月第28卷第2期中國糧油學(xué)報(bào)JournaloftheChineseCerealsOilsAssociationVol28，No2Feb.2013黏紅酵母產(chǎn)油脂培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化李市場張鵬鵬楊娜張晶王永杰(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽471003)摘要利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)相結(jié)合，對(duì)黏紅酵母產(chǎn)油脂培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。單因素試驗(yàn)得到初步發(fā)酵培養(yǎng)基成分為葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4。經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖

2、含量為7340gL，蛋白胨含量為106gL，KH2PO4含量為356gL時(shí)，油脂產(chǎn)量的理論預(yù)測值可達(dá)到349gL，比優(yōu)化前提高了13%。氣相分析其油脂組成，多不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2697%。然后又對(duì)高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行研究，在10d時(shí)，生物量和油脂產(chǎn)量達(dá)到最高，此時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，生物量為4798gL(菌體濕重)，油脂產(chǎn)量達(dá)到781gL。關(guān)鍵詞響應(yīng)面分析黏紅酵母培養(yǎng)基優(yōu)化酸熱耦合超聲波法發(fā)酵特性中圖分類號(hào):Q815文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編

3、號(hào):1003－0174(2013)02－0063－06基金項(xiàng)目:河南科技大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練計(jì)劃(SRTP)基金(2010044)收稿日期:2012－05－02作者簡介:李市場，男，1976年出生，博士，副教授，微生物育種和酶工程微生物油脂是微生物以碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭瑸樘?、氮源，輔以無機(jī)鹽生產(chǎn)的一種商業(yè)價(jià)值較高的油脂［1］。隨著世界人口的不斷增多，動(dòng)植物油脂的生產(chǎn)已無法滿足市場需求，所以開發(fā)利用微生物進(jìn)行油脂的工業(yè)化生產(chǎn)成為

4、一大研究熱點(diǎn)。微生物油脂具有生長周期短，不受氣候季節(jié)變化影響，不占用耕地等的優(yōu)點(diǎn)，但是微生物油脂也有其局限性，最明顯的一點(diǎn)就是微生物細(xì)胞通常含油量低，僅含2%～3%的油脂，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，但是在特定條件下某些微生物干菌體含油率可達(dá)80%～90%，油脂產(chǎn)量可達(dá)15gL左右，這使微生物油脂的工業(yè)化生產(chǎn)成為可能［2］。目前國內(nèi)外主要通過菌種篩選及誘變和優(yōu)化發(fā)酵條件等手段來提高油脂產(chǎn)量［3］。為了提高微生物油脂產(chǎn)量，將單因素試驗(yàn)和響應(yīng)

5、面分析法(RSM)用于黏紅酵母菌體的發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，以油脂含量為響應(yīng)值，采用多元二次回歸擬合出方程，得培養(yǎng)基各營養(yǎng)物質(zhì)的最佳配比。1材料與方法11菌種黏紅酵母(Rhodotulaglutinis)D30:中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)的黏紅酵母31596誘變所得的高產(chǎn)菌株［4］。12培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基:加入2%瓊脂和2%蛋白胨的10%麥芽汁，pH:58，115℃，滅菌30min。種子培養(yǎng)基:加入2%蛋白胨的10%麥芽汁，pH:5

6、8，115℃，滅菌30min。發(fā)酵培養(yǎng)基(gL):葡萄糖:80蛋白胨:18KH2PO4:25pH:58，115℃，滅菌30min。13培養(yǎng)工藝斜面培養(yǎng):轉(zhuǎn)接斜面后置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h，4℃保藏種子培養(yǎng):從斜面刮取3環(huán)菌體，接種于種子培養(yǎng)基中(250mL三角燒瓶裝液30mL)，28℃搖床轉(zhuǎn)速為190rmin培養(yǎng)20h。發(fā)酵培養(yǎng):按9%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(裝液量為250mL三角瓶裝液30mL)，28℃搖床轉(zhuǎn)速為190

7、rmin培養(yǎng)96h。14油脂提取由于黏紅酵母所產(chǎn)生的油脂屬于胞內(nèi)物質(zhì)，要提取出油脂必須要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎［5－6］。向離心收集好的菌體加入10mL4molL鹽酸，振蕩混勻，室溫放置30min后，沸水浴5min，－20℃速冷10min然后使用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)一步破碎細(xì)胞，超聲功率200W，全程時(shí)間5min，超聲時(shí)間3s，間歇時(shí)間4s。加入2倍體積氯仿∶甲醇(2∶1)提取液，充分振蕩，4000rmin離心25min，取氯仿層，加等體積01%

8、氯化鈉溶液，混勻，4000rmin離心25min，取第28卷第2期李市場等黏紅酵母產(chǎn)油脂培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化22響應(yīng)面優(yōu)化黏紅酵母發(fā)酵培養(yǎng)基221響應(yīng)面分析因素水平的選取利用Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)［10］對(duì)培養(yǎng)基的3種成分葡糖糖、蛋白胨、KH2PO43個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。以葡糖糖(X1)、蛋白胨(X2)、KH2PO4(X3)為變量，每個(gè)變量按低、中、高3個(gè)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，其中高低值分別為中間值得正負(fù)15倍。試驗(yàn)

9、因素及水平見表1。表1響應(yīng)面分析因素和水平編碼X1葡萄糖gLX2蛋白胨gLX3KH2PO4gL－153312080153112022545222響應(yīng)面法分析結(jié)果根據(jù)表1的因素和水平，以X1、X2、X3為自變量，以最后所得油脂重量為響應(yīng)值(Y)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。表2響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案及結(jié)果試驗(yàn)號(hào)X1X2X3油脂產(chǎn)量gL1－1－102782－11024531－10285411019650－1－115560－11282701－11208

10、0112029－10－11201010－115511－10127512101220130002991400029615000311以油脂產(chǎn)量為響應(yīng)值。根據(jù)表2中Box—Behnken設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果。運(yùn)用SAS軟件［11］對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析。得到二次回歸方程(predictivemodelfY)如下:Y1=302－0075X1－029625X2053625X3－024125X12－014X1X2－0225X1X3－026875X

11、22－01125X2X3－01125X32R2=9967%AdjR2=9908%從方差分析表3可以看出模型在α=001水平上回歸顯著，失擬項(xiàng)反映的是試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況，P=0753157＞01，失擬不顯著，因此模型選擇正確［12］。同時(shí)，一次項(xiàng)、平方項(xiàng)、交叉項(xiàng)均對(duì)響應(yīng)值有顯著性影響。從表3可模擬分析可信度，通過模擬分析可知，其中復(fù)相關(guān)系數(shù)的平方R2=9967%說明模型可以解釋9967%試驗(yàn)所得油脂產(chǎn)量的變化。表明方程擬合較好。表

12、3回歸方程的方差分析方差來源自由度平方和均方差F值P值顯著性X11004800481156400192＊＊X210702070216898000001＊＊X3123005230055367300001＊＊X121021502155172000009＊＊X1X21007800781886900074＊＊X1X31020202024873700009＊＊X221026702676418400005＊＊X2X31005100511218400

13、175＊＊X3212691269164772200001＊＊Model96324070316910100001＊＊Lackoffit300090003043207532模型200130006總計(jì)146345注:顯著，＊＊極顯著223響應(yīng)面圖及等高線因子的交互作用效應(yīng)可以從響應(yīng)曲面的坡度變化及等高線的形狀得到反映，響應(yīng)曲面坡度的平緩與陡峭程度，表明在培養(yǎng)基配比變化時(shí)黏紅酵母產(chǎn)油量的響應(yīng)靈敏程度［13－14］。如果響應(yīng)曲面坡度相對(duì)平緩，響應(yīng)