畢赤酵母表達(dá)XRN1蛋白及響應(yīng)面法優(yōu)化基礎(chǔ)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基.pdf

1、5'-3'核糖核酸外切酶(XRN1)是一個(gè)在基因表達(dá)過(guò)程中與RNA代謝和RNA干擾等重要功能相關(guān)的保守酶大家族，存在于所有真核生物中，簡(jiǎn)稱5PX。XRN1能持續(xù)降解5'端單磷酸的RNA，而不能對(duì)5'端三磷酸、5'帽子結(jié)構(gòu)、5'羥基的RNA發(fā)揮作用。在總RNA中，rRNA含量最高，原核生物的16S與23SrRNA和真核生物18S與28SrRNA5'端均為單磷酸，末端核酸外切酶XRN1可將這些rRNA降解去除，而達(dá)到富集mRNA的目的。

2、r>　　 已知釀酒酵母S288c的Xrn1基因序列長(zhǎng)4587bp，編碼1528aa。通過(guò)生物學(xué)軟件對(duì)其蛋白分子量和等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得出分子量約為175kDa，等電點(diǎn)在7.3左右。本論文利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)釀酒酵母S288c的XRN1，篩選高效表達(dá)XRN1重組蛋白的體系，同時(shí)優(yōu)化基礎(chǔ)鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)，并分離純化重組蛋白，鑒定重組酶活性，為mRNA的富集奠定基礎(chǔ)。
　　 通過(guò)構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC3.

3、5K-Xrn1，重組載體經(jīng)SalⅠ線性化后，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115，然后通過(guò)甲醇誘導(dǎo)實(shí)現(xiàn)了XRN1蛋白在畢赤酵母中的胞內(nèi)表達(dá)。結(jié)果表明酵母胞內(nèi)表達(dá)量組菌可以表達(dá)全長(zhǎng)XRN1重組蛋白，經(jīng)Western blotting鑒定其大小約為175kDa，與目的蛋白大小基本相符。用Bradford法可測(cè)純化濃縮后的真核蛋白酶液的濃度:活性檢測(cè)表明，此重組蛋白具有5'-3'核糖核酸酶活性。
　　 最后利用響應(yīng)面法對(duì)畢赤酵母初始鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

4、進(jìn)行優(yōu)化。首先應(yīng)用Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)法對(duì)影響XRN1蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行篩選，選取的8個(gè)相關(guān)因子為:酵母提取物、硫酸鈣、MgSO4·7H2O、甘油、硫酸鉀、磷酸、硫酸銨和氫氧化鉀。統(tǒng)計(jì)分析表明，影響XRN1蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因子為酵母提取物、硫酸鎂和硫酸鉀。再進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)逼近3個(gè)關(guān)鍵因素的最大響應(yīng)區(qū)域的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken Design法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，其最佳條件為酵母提取物0.4