2012版分子細胞生物學的研究方法-期末

1、....一陳瑞川（1）GenetransfertogetstablecelllineA.Transient（短暫的）transfection1.Liposome（脂質體）mediatedgenetransfer:Lipofectamine（脂質體）transfection2.Ca2.Ca2.Ca33(PO(PO(PO44))22––mediatedmediatedmediatedgenegenegenetransfertransfert

2、ransfer3.PEI3.PEI3.PEI（（聚乙二胺））mediatedmediatedmediatedgenegenegenetransfertransfertransfer4.4.4.ElectropationElectropationElectropation（（電穿孔））B.Stabletransfection1.Adenovirusinfection（腺病毒感染）2.Retrovirusinfection（反轉錄病毒載體法

3、）3.Lentivirusinfection（慢病毒載體轉染法）4.Cotransfection.（2）HowtogetStablecellline1.Infectioncotransfection2.Antibioticsion3.Coloniesgrowth4.Expressiondetection5.Celllinestage（（33））HomologyHomologyHomologysearchsearchsearchofofo

4、fexistingexistingexistingcDNAcDNAcDNAdatadatadatabasesbasesbasesGenBankGenBankGenBankBlastBlastBlastNCBINCBINCBIBlastBlastBlastHomeHomeHomePage::www.ncbi.nlm.nih.govBLASTPage::www.ncbi.nlm.nih.govBLASTPage::www.ncbi.nlm.

5、nih.govBLASTGoGoGotototoProteinProteinProteinBlastBlastBlastPagePagePagePastePastePasteyouryouryourproteinproteinproteinsequencesequencesequenceenterenterenteraccessionaccessionaccessionnumbernumbernumberofofofyouryouryo

6、urproteinproteinproteinintointointothethetheboxboxboxUsuallyUsuallyUsuallyProteinproteinProteinproteinProteinproteinBlast.Blast.Blast.AK056946AK056946AK056946HomoHomoHomosapienssapienssapienscDNAcDNAcDNAFLJ32384FLJ32384F

7、LJ32384fisfisfiscloneclonecloneSKMUS1000104SKMUS1000104SKMUS1000104weaklyweaklyweaklysimilarsimilarsimilartototoHomoHomoHomosapienssapienssapiensmRNAmRNAmRNAfffHEXIM1HEXIM1HEXIM1proteincompleteproteincompleteproteincompl

8、etecds.cds.cds.二二二二俞春東俞春東俞春東俞春東（（11））什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？什么是近交系小鼠？它們有什么特性？有哪些常用的近交系小鼠？答：答：答：近交系小鼠：近交系小鼠：近交系小鼠：近交系小鼠：是經連續(xù)是經連續(xù)是經連續(xù)202020代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）的全同胞兄妹交配（或親代與子代代（或以上）

9、的全同胞兄妹交配（或親代與子代交配）培育而成的小鼠，品系內所有個體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內所有個體都可追溯到起源于第交配）培育而成的小鼠，品系內所有個體都可追溯到起源于第202020代或以后代或以后代或以后代數的一對共同祖先。代數的一對共同祖先。代數的一對共同祖先。特性：特性：特性：特性：1.1.1.基因位點的純合性（基因位點的純合性（基因位點的純合性（HomozygosityHomozygosityHomozyg

10、osity））近交系動物中任何一個基因位點上純合子的概率高達近交系動物中任何一個基因位點上純合子的概率高達近交系動物中任何一個基因位點上純合子的概率高達999999％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖％，因而也能繁殖....毛色毛色毛色agoutiagoutiagouti棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）棕褐色（顯性）應用：1980年代，具穩(wěn)定性的小鼠胚胎干細胞株皆源自129Sv純系小鼠。1990年代，基因定位(genetargeting)試驗結

11、果證實其為極成功的動物模型。4.4.4.FVBFVBFVB系系毛色白化毛色白化毛色白化起源起源起源源自遠交系源自遠交系源自遠交系SwissSwissSwiss鼠。鼠。鼠。193519351935年，在年，在年，在NIHNIHNIH飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，飼養(yǎng)，196619661966年起開始選育，在年起開始選育，在年起開始選育，在接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系接種百日咳疫苗后，其中一系HSFSNHSFSNHSFSN對組胺對組胺

12、對組胺(Histamine)(Histamine)(Histamine)敏感。敏感。敏感。707070年代年代年代初，在初，在初，在HSFSNHSFSNHSFSN系第八代發(fā)現部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現部份小鼠攜帶系第八代發(fā)現部份小鼠攜帶Fv1Fv1Fv1bb基因對基因對基因對BBstrainstrainstrainFriendFriendFriend白白血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成血病毒敏感，后育成Fv1Fv1Fv1bb同型合子近

13、交系，稱同型合子近交系，稱同型合子近交系，稱FVBFVBFVB。。NIHNIHNIH、、JacksonJacksonJackson等保等保等保存。存。存。應用：應用：應用：FVBFVBFVB通用于轉基因實驗，有較強的繁殖力，窩仔數多，受精卵有大而顯通用于轉基因實驗，有較強的繁殖力，窩仔數多，受精卵有大而顯通用于轉基因實驗，有較強的繁殖力，窩仔數多，受精卵有大而顯著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射著的前核，易于顯微注射DNADN

14、ADNA。。3.3.3.我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系我國培育的小鼠近交系1946年，我國從印度Haggkine研究所引入小鼠，這是當今廣泛應用的昆明種小鼠昆明種小鼠的原種。應用優(yōu)點應用優(yōu)點應用優(yōu)點應用優(yōu)點（（11）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實驗反應一致，因此，只需用少量的動物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實驗反應一致，因此，只需用少量的動物就）遺傳組成和遺傳性狀一致，對實驗反應一致，因此，只需用少量的動物

15、就可得到非常規(guī)律的實驗結果?？傻玫椒浅Ｒ?guī)律的實驗結果?？傻玫椒浅Ｒ?guī)律的實驗結果。（（22）組織相容性抗原一致，異體移植不產生排斥反應，是組織細胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產生排斥反應，是組織細胞和腫瘤移植）組織相容性抗原一致，異體移植不產生排斥反應，是組織細胞和腫瘤移植實驗中最為理想的材料。實驗中最為理想的材料。實驗中最為理想的材料。（（33）明顯的生物學特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受）明顯的生物學

16、特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受）明顯的生物學特征，如先天畸形，高腫瘤發(fā)病率，對某些因子敏感和耐受等，這些特點在醫(yī)學研究中是天然模型。等，這些特點在醫(yī)學研究中是天然模型。等，這些特點在醫(yī)學研究中是天然模型。（（44）多個近交系同時使用不僅可分析不同遺傳組成對某項實驗的不同反應與影）多個近交系同時使用不僅可分析不同遺傳組成對某項實驗的不同反應與影）多個近交系同時使用不僅可分析不同遺傳組成對某項實驗的不同反應與影響，還可

17、觀察實驗結果是否具有普遍意義。響，還可觀察實驗結果是否具有普遍意義。響，還可觀察實驗結果是否具有普遍意義。190919091909年，年，年，C.C.C.C.C.C.LittleLittleLittle首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了首先采用近親繁殖，培育了DBADBADBA近交系小鼠，成為實驗動物近交系小鼠，成為實驗動物近交系小鼠，成為實驗動物發(fā)展史上發(fā)展史上發(fā)展史上第一個近交系動物。第一個近交系動物。第一個近交系動物

18、。第一個近交系動物。（（22））設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用。設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用。設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用。設計實驗，用基因敲除的方法研究一個基因的作用?；蚯贸ɑ蚯贸ɑ蚯贸ɑ蚯贸╧nockoutknockoutknockout））是是202020世紀世紀世紀808080年代后半期應用年代后半期應用年代后半期應用DNADNADNA同源重組原理發(fā)展起來同源重組原理

19、發(fā)展起來同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術，指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實的一門新技術，指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實的一門新技術，指對一個結構已知但功能未知的基因，從分子水平上設計實驗，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推驗，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推驗，將該基因去除或用其他序列相近基因取代，然后從整體觀察實驗動物，推測相應基因

20、的功能。測相應基因的功能。測相應基因的功能。目前，建立基因敲除動物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動物最常使用的是小鼠（常用的品系為目前，建立基因敲除動物最常使用的是小鼠（常用的品系為129SV129SV129SV）的）的）的ESESES細胞細胞細胞主要是因為主要是因為主要是因為ESESES細胞是利用小鼠囊胚內細胞團中的多潛能細胞建立的，在體細胞是利用小鼠囊胚內細胞團中的多潛能細胞建立的，在體細胞是利用小鼠囊胚內細胞團中

21、的多潛能細胞建立的，在體外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（外白血病抑制因子（LIFLIFLIF）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外）可維持其多潛能未分化的狀態(tài)，另外ESESES細胞有細胞有細胞有利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。利于各種體外操作，具有發(fā)育成胚系各種組織的能力。步驟：步驟：1.構建打靶載體（含有一段與欲敲除的基因具有高度同源性外