應(yīng)用實時定量RT-PCR和蛋白免疫印跡研究CTV的蚜傳特性.pdf

1、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘衰退病是世界性的柑橘病毒病害，分布于世界各主要柑橘產(chǎn)區(qū)；作為柑橘產(chǎn)量大國，柑橘是我國南方農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要支撐。然而我國廣泛分布 CTV最有效傳毒媒介—褐色橘蚜（Toxoptera citricida，Kirkaldy），加之柚類、甜橙品種增多的產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，使CTV對我國柑橘產(chǎn)區(qū)的危害日趨嚴(yán)峻。柑橘衰退病自發(fā)現(xiàn)以來已近一個世紀(jì)，各科研工作者對CTV進(jìn)行了大量研究，

2、以期為CTV的防治提供依據(jù)；但迄今為止，CTV的蚜傳機(jī)制仍不明確。
　　昆蟲媒介傳播半持久性植物病毒包括獲毒、傳毒兩個階段；迄今為止，關(guān)于褐色橘蚜傳毒特性研究主要集中于褐色橘蚜獲毒過程對其傳毒率的影響，例如:蚜蟲獲毒量及CTV毒源含毒量、蚜蟲發(fā)育蟲態(tài)及蟲口密度、蚜蟲獲毒時間、CTV毒源株系和CTV毒源品種等因素對傳毒率的影響；對傳毒過程的研究僅限于受毒植株品種。并且，關(guān)于蚜蟲獲毒量、CTV毒源含毒量對CTV蚜傳率的影響主要是從基因

3、方面入手。對于蚜蟲獲毒后，傳毒過程中其體內(nèi)CTV含量與傳毒率的關(guān)系尚無報道。
　　本研究基于前人研究結(jié)果，對褐色橘蚜EF-1α、EF-2、RAPAO、RPL5和Actin五個內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行評價，并利用實時熒光相對定量 RT-qPCR方法，基于CT11、CT14、CT16-2和CT立間四種不同蚜傳率CTV分離株研究獲毒褐色橘蚜在健康植株上傳毒不同時間所攜帶 CTV的含量，并分析了攜毒橘蚜中 CTV含量與在健康植株上取食時間的關(guān)系

4、和與傳毒率的關(guān)系；利用western blot技術(shù)從蛋白層面分析植物蛋白含量對蚜傳率的影響；以期為揭開蚜蟲傳播CTV機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　主要研究成果：
　　1.利用Genorm、Normfinder和Bestkeeper三個內(nèi)參分析軟件評價了在不同CTV毒源影響下，褐色橘蚜EF-1α、EF-2、RAPAO、RPL5和Actin五個內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性；用Genorm和Normfinder分析時穩(wěn)定性順序為RAPAO>EF-1

5、α>EF-2> Actin> RPL5，用Bestkeeper分析時穩(wěn)定性順序為RAPAO> EF-1α>EF-2>RPL5>Actin，結(jié)合Genorm軟件基因標(biāo)準(zhǔn)化因子配對差異分析Vn/（n+1)<0.15篩選出在該條件下最好用EF-1α和RAPAO進(jìn)行多內(nèi)參校正；
　　2.獲毒CT11、CT14毒源的攜毒褐色橘蚜中 CTV相對表達(dá)量在帶毒橘蚜取食健康植株0.5 h就顯著降低，0~3 h內(nèi)降低較快，3~9 h時間段內(nèi)無顯著變化

6、，相對表達(dá)量在0.10~0.18范圍內(nèi)，12~48 h時間段內(nèi)無顯著變化，相對表達(dá)量在0.03~0.07范圍內(nèi)；
　　3.獲毒CT16-2毒源的攜毒褐色橘蚜中CTV相對表達(dá)量在帶毒橘蚜取食健康植株9 h內(nèi)均無顯著變化，相對表達(dá)量在0.12~0.18范圍內(nèi)，12 h時顯著降低，相對表達(dá)量為0.06，12~48 h時間段內(nèi)無明顯差異，相對表達(dá)量在0.01~0.06范圍內(nèi)；
　　4.獲毒CT立間毒源的攜毒褐色橘蚜中CTV相對表達(dá)量

7、在帶毒橘蚜取食健康植株0.5 h顯著降低；取食3~6 h時間段內(nèi)，褐色橘蚜中CTV含量無顯著性差異，相對表達(dá)量在0.10~0.14范圍內(nèi)，之后顯著降低；9~24 h時間段內(nèi)無顯著性差異，相對表達(dá)量在0.05~0.07范圍內(nèi)；
　　5.利用SDS-PAGE比較尿素提取法、TCA-酚沉淀法、PBS法和TCA-丙酮沉淀法四種快速蛋白提取法提取甜橙和葡萄柚兩種柑橘品種的提取效果；PBS法和TCA丙酮法提取效率較低，TCA-酚和尿素提取法提