bnaa.ban.a調控甘藍型油菜種皮色素成分的研究

1、朱寶：占h 以．B A N ．a 調控甘藍型油菜種皮色素成分的研究目錄摘要?????????????????????????????????????．i i iA b s t r a c t ??????????????????????????????．?????????????．?．???．v中英文對照表?????????????????????????????????．v i i第一章文獻綜述????????????????????

2、????????????11 ．1 油菜的經濟地位及其育種現狀??????????????????????．．11 ．2 黃籽油菜的研究價值及育種現狀?????????????????????．．11 ．3 油菜黃籽性狀分子調控機制的研究進展??????????????????．．21 ．3 ．1 類黃酮合成途徑相關化合物的研究進展????????????????21 ．3 ．2 類黃酮合成途徑分子機制的研究進展????????????

3、?????41 ．3 ．3 轉錄因子對類黃酮合成途徑調控的研究進展??????????????61 ．3 ．4 花青素還原酶基因( 鰣Ⅳ) 結構和功能的初步研究??????????．1 01 ．4 本研究的目的和意義??????????????????????????．1 1第二章材料和方法???????????????????????????????1 22 ．1 實驗材料???????????????????????????????

4、。1 22 ．2 菌株與質粒???????????????????????????????1 22 ．3 試劑與儀器???????????????????????????????1 22 ．4 實驗方法????????????????????????????????1 22 ．4 ．1 日”朋Ⅳ的生物信息學分析?????????????????????。1 22 ．4 ．2 黃、褐籽甘藍型油菜不同發(fā)育時期種子中B n B A N 的表達

5、水平分析???．1 32 ．4 ．3B n a A ．朋Ⅳ．口在甘藍型油菜不同組織中的表達量分析??????????1 52 ．4 ．4B n a A ．B A N ．a 表達蛋白在細胞中的定位????????????????．1 52 ．4 ．5B n a A ．B A N ．a 過表達載體的構建???????????????????．1 72 ．4 ．6B n a A ．B A N ．a 干擾載體的構建???????????????

6、?????．1 72 ．4 ．7B n a A ．B A N ．a 干擾載體及過表達載體轉化農桿菌????????????1 82 ．4 ．8B n a A ．B A N ．a 干擾載體及過表達載體的油菜遺傳轉化??????????1 82 ．4 ．9T o 代轉基因植株的檢測???????????????????????2 02 ．4 ．1 0T l 代轉基因植株的檢測??????????????????????．2 1第三章 結果與

7、分析???：???????????????????????????2 43 ．1B n B A N 基因的生物信息學分析??????????????????????2 43 ．1 ．1 四h 刪Ⅳ四條拷貝數的生物信息學分析????????????????．2 43 ．1 ．2B n B A N 不同拷貝數的同源性比較分析????????????????．2 43 ．1 ．3B A N 基因在蕓苔屬作物中的系統(tǒng)進化關系??????????

8、????．2 63 ．2B n B A N 不同拷貝在黃、褐籽不同發(fā)育時期的相對基因表達量????????．．2 73 ．3 甘藍型油菜不同組織與種子不同發(fā)育時期B n a A ．B A N ．a 的表達量分析?????2 83 ．4B n a A ．B A N ．a 在煙草中的蛋白定位研究???????????????????2 93 ．4 ．1p E G A D —B n a A ．B A N ．a 過表達載體的構建????????

9、????????2 93 ．4 ．23 5 S ：B n a A ．B A N ．a —G F P 在煙草葉表皮中的亞細胞定位??????????3 03 ．5 B n a A ．B A N ．a 在甘藍型油菜中的遺傳轉化??????????????????3 03 ．5 ．1 p S B l 3 0 一召h 鰣．B A N ．a 過表達載體的構建????????????????3 03 ．5 ．2p S B l 3 0 一B n a

10、A ．B A N ．a 干擾載體的構建?????????????????3 13 ．5 ．3 甘藍型油菜的遺傳轉化流程????????????????????．．3 33 ．5 ．4T o 代轉基因植株的鑒定???????????????????????3 33 ．5 ．5T ．代轉基因植株的鑒定???????????????????????3 53 ．5 ．6T 。代轉基因植株的多酚類物質的測定????????????????．．3

11、6朱寶：B n a A ．B A N ．a 調控甘藍型油菜種皮色素成分的研究B n a A ．B A N ．a 調控甘藍型油菜種皮色素成分的研究摘要B A N Y U L S ( 脅r ) 是原花青素合成途徑中的重要結構基因，主要編碼花青素還原酶，這種花青素還原酶可以將花青素還原成原花青素。目前，擬南芥中A t B A N 基因在種子類黃酮合成途徑中的分子機理研究得較為清楚，該基因的突變可使擬南芥種皮顏色變淺。但該基因在甘藍型油菜中功能

12、還未進行深入的研究。本實驗基于前期黃、褐籽甘藍型油菜不同發(fā)育時期種子的數字基因表達譜分析，篩選獲得了黃、褐籽甘藍型油菜差異表達基因。我們重點關注類黃酮合成路徑的差異表達基因，發(fā)現該路徑的多個基因的表達量發(fā)生了變化，其中B n B A N 的一個拷貝在黃籽中發(fā)生明顯下調表達。本文擬通過過表達和R N A 干擾等技術了解甘藍型油菜中B n B A N 基因對油菜種皮色素成分的影響，為探究甘藍型油菜種皮色澤變異奠定基礎。通過生物信息學的分析發(fā)

13、現B n B A N 基因在甘藍型油菜中具有四個拷貝，其中a 、b 拷貝編碼的氨基酸數目和蛋白的分子量是一致的。通過對蕓苔屬作物和擬南芥中B n B A N 基因的系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現B n B A N 基因在蕓苔屬作物和擬南芥中的同源性較高，達到了8 8 ．7 0 ％。因此，我們對B n B A N 基因的調控機制進行研究時可以參照擬南芥中的研究方法。通過對甘藍型油菜中不同組織的q P C R 檢測，發(fā)現B n a A ．B A N

14、．a 基因在油菜不同組織中的表達量有明顯差異，在花苞中表達量最高，而在根中的表達量最低；通過對授粉后3 —6周種子中該基因的q P C R 表達分析發(fā)現，種子中B n a A ．B A N ．a 基因的表達量是逐漸上升的，在第6 周基因的表達量達到最大值。這樣我們就了解了覷刎．B A N ．a 在不同組織和種子發(fā)育不同時期的基因表達模式，為研究上游轉錄因子的調控機制提供了基礎。另外通過研究砌鰣．B A N ．a 表達蛋白在煙草中的亞細胞

15、定位情況，我們發(fā)現B n a A ．B A N ．a 在煙草表皮細胞的細胞膜、細胞核中均有熒光，這為研究B n a A ．B A N ．a 編碼的蛋白功能提供一個細胞學上的參考。但是這只是在異源植物中進行研究，要準確確定砌訓．B A N ．a 蛋白是在細胞核與細胞膜中表達，還需要在甘藍型油菜的原生質體中進行具體研究。。由于甘藍型油菜中沒有b a n 突變體，所以本文將采用I ⅢA i 的方法降低甘藍型油菜中B n a A ．B A N