分子信標(biāo)技術(shù)定量檢測脲原體u.parvum和u.urealyticum及臨床應(yīng)用研究

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文分子信標(biāo)技術(shù)定量檢測脲原體U.Parvum和U.Urealyticum及臨床應(yīng)用研究姓名：張新申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：蒲曉允20061101第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文度均為1 0 拷貝／p 1 的重組質(zhì)粒D N A 。3 、U ．P 和U ．U 分子信標(biāo)的S ／B 值均大于2 0 。分子信標(biāo)熱變性曲線表明分子信標(biāo)只有與互補(bǔ)的寡核苷酸結(jié)合才有熒光強(qiáng)度的升高，并且分子信標(biāo)在5 5 ℃以下時當(dāng)有目

2、的片段存在時可以形成穩(wěn)定的雜交，而無結(jié)合目的片段的分子信標(biāo)貝l j 形成穩(wěn)定的“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，熒光背景低。4 、U ．P 分子信標(biāo)熒光定量P C R 反應(yīng)體系中M g C l 2 、引物、d N T P 、U ．P 分子信標(biāo)最佳終濃度分別為4 ．5m m o l ／l 、O ．3 “m o l ／l 、O ．3 m m o l ／l 、O ．3 肛m o l ／1 。U ．U 分子信標(biāo)熒光定量P C R 反應(yīng)體系中M g C l 2 、引

3、物、d N T P 、U ．U 分子信標(biāo)的最佳終濃度分別為5 ．Om m 0 1 ／l 、O ．3 “m 0 1 ／1 、O ．4 m m 0 1 ／1 、O ．3 “m 0 1 ／1 。2 個定量P C R 體系均能檢測1 拷貝／“1 的標(biāo)準(zhǔn)模板，檢測上限可到1 0 6 拷貝／肚1 。5 、其它1 5 株細(xì)菌與2 個分子信標(biāo)熒光定量P C R 反應(yīng)體系無交叉反應(yīng)。批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)C V 均小于2 ％，天間重復(fù)性試驗(yàn)C V 均小于5 ％。

4、6 、U ．P 和U ．U 分子信標(biāo)定量P C R 反應(yīng)體系檢測臨床標(biāo)本脲原體的總陽性檢出率為6 0 ．4 ％( 2 9 ／4 8 ) ，其中U P 口知“聊陽性2 0 例，而U 己杷以咖f f c “聊陽性9 例。2 個分子信標(biāo)定量P C R 反應(yīng)體系與培養(yǎng)法的陽性檢出率( 3 9 ．6 ％，1 9 ／4 8 ) 比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，PO ．0 5 ，但高于兩者的陽性檢出率。以培養(yǎng)法作為參考方法，U ．P 和U ．U 分子信標(biāo)熒光定量P

5、 C R 反應(yīng)體系的靈敏度和特異性分別為：9 4 ．7 ％和6 2 ．1 ％，U ．P 和U ．U 定性P C R 反應(yīng)體系的靈敏度和特異性分別為：9 4 ．7 ％和7 2 ．4 ％，華美P C R 法的靈敏度和特異性為：9 4 ．7 ％和6 5 ．5 ％。結(jié)論：1 、U ．P 和U ．U 定性P C R 反應(yīng)體系能夠?qū)﹄逶w標(biāo)準(zhǔn)株及臨床標(biāo)本中脲原體進(jìn)行分種鑒別并具有高度的特異性和靈敏性，可以滿足臨床上對脲原體進(jìn)行分種鑒別的要求，同時為

6、分子信標(biāo)熒光定量P C R 方法的建立奠定了基礎(chǔ)；2 、U ．P 和u ．u 分子信標(biāo)S ／B 值及熱變性曲線能夠充分反映分子信標(biāo)的高度靈敏性、特異性以及熱動力學(xué)變化特征，為成功建立分子信標(biāo)實(shí)時熒光定量P C R 方法提供了保障；3 、兼顧到多種因素對分子信標(biāo)熒光定量P C R 反應(yīng)體系的影響，建立了一套較為合理的分子信標(biāo)實(shí)時熒光定量P C R 反應(yīng)體系的優(yōu)化方案；4 、U ．P 和U ．U 分子信標(biāo)實(shí)時熒光定量P C R 反應(yīng)體系能夠