復(fù)合通用cd439;t輔助細(xì)胞表位基因克隆、表達(dá)、純化及初步應(yīng)用

1、 武漢生物制品研究所2 0 0 8 屆博士研究生畢業(yè)論文淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)與T T 相當(dāng)，增殖指數(shù)分別為4 ．2 1 6 和4 ．7 3 6 ，而免疫原性遠(yuǎn)低于T T ，特異性I g G 幾何平均滴度( G M T ) 分別為1 ：1 5 7 5 8 ．6 5 和1 ：6 7 5 5 8 ．8 1 ( P < O ．0 5 ) 。結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白P e p l O 具有良好的淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)和較低的免疫原性，其可能作為一種新

2、型載體蛋白用于細(xì)菌多糖結(jié)合疫苗的研制。第三部分：采用兩種方法制備A 群腦膜炎球菌多糖( G A M P ) 一重組蛋白P e p l O結(jié)合物。方法一：將A 群腦膜炎球菌多糖( G A M P ) 經(jīng)溴化氰( C N B r ) 活化后，共價(jià)接合己二酰肼( A D H ) 手臂獲得G A M P - A D H 衍生物，衍生率為1 ．2 8 ％。衍生物在碳二亞胺( E D A C ) 催化下與重組蛋白P e p l O 偶聯(lián)制備結(jié)合物G

3、 A M P —A D H —P e p l O 。結(jié)合物經(jīng)S e p h a r o s e 4 F F 凝膠過濾層析純化后，收集結(jié)合物組份分別測(cè)定多糖和蛋白質(zhì)含量及K D 值，計(jì)算得出多糖／蛋白質(zhì)比值為O ．9 7 ，K D 值為0 ．1 l ；免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)證明結(jié)合物能夠與抗A 群流腦多糖單克隆抗體產(chǎn)生沉淀線，說明結(jié)合物偶聯(lián)成功，并具有良好的抗原性。方法二：將A 群腦膜炎球菌多糖( G A M P ) 經(jīng)酸水解后，獲得平均聚合度(

4、 a v D P )為9 ．2 l 的寡糖混合物，隨后在N H 。C 1 和N a B H 。C N 作用下進(jìn)行氨化反應(yīng)，氨化率為3 8 ％；氨化寡糖經(jīng)S e p h a d e x G - 1 5 純化后共價(jià)結(jié)合S I D E A 獲得G A M P - S I D E A 衍生物，衍生率為4 7 ％，衍生物經(jīng)1 - 4d i o x a n e 沉淀后與重組蛋白P e p l O 在N i - N T As u p e r f l

5、o w 親和層析柱上固相結(jié)合，以含有2 5 0 n 刪I 咪唑的l O O m M 磷酸鈉緩沖液競(jìng)爭(zhēng)洗脫而獲得結(jié)合物G A M P —S I D E A —P e p l 0 ，計(jì)算結(jié)合物中寡糖和蛋白含量，得寡糖／蛋白比值為0 ．6 2 。取6 周齡雌性B a l b ／c 小鼠6 0 只，隨機(jī)分A ～F 共6 組，每組1 0 只。A ～D組于第0 、1 5 、2 9 天分別腹部皮下注射l O O p l ( 含G A M P 2 ．5

6、 “g ) 的G A M P 、G A M P —A D H —T T 、G A M P —A D H —P e p l 0 、G A M P - S I D E A - P e p l O ，并于第一1 、1 4 、2 8 、4 5 天眼眶采血；E 、F 組先于一3 0 天分別注射l O O p l ( 含蛋白5 0 p g ) 的T T 和P e p l O ，再按上述程序注射相應(yīng)的結(jié)合物并采血，用間接E L I S A 法檢i 貝