提高紫花苜蓿medicagosatival.耐鋁毒能力的遺傳操作

1、Y 9 3 7 t t 8 5單位代碼! Q §3 5學 號2 Q 鯉3 鯉西南．矢學碩士學位論文提高紫花苜蓿( M e d i c a g o s a t i v aL ．) 耐鋁毒能力的遺傳操作論文作者：胡清泉指導(dǎo)教師：玉永雄教授陳麗梅教授學科專業(yè)：動物營養(yǎng)與飼料科學研究方向：飼料飼草生產(chǎn)學( 牧草生物技術(shù))提交論文日期：2 0 0 6 年5 月論文答辯日期：2 0 0 6 年6 月學位授予單位：西南大學中國·重

2、慶2 0 0 6 年5 月掰南大學碩士學彼論文 摘嬰G e n e t i ce n g i n e e r i n gf o r t h ee n h a n c e m e n t o f a l u m i n u mt o l e r a n c e i nM e d i c a g o s a 菇v aLA b s t r a c tA l f a l f a ( M e d i c a g o s a t i v a L t

3、 ) i s o n e o f t h e m o s th i g h l y v a l u a b l e f o r a g e 。B e c a u s e o f i t sa d v a n t a g e ，i ti sw i d e l yu s e df o rl i v e s t o c ka n d p o n l t r y ’sf o o da n d t oi m p r o v e s o i l t

4、 i l t h ．A l f a l f ag r o w sw e f ti nn e u t e ro r a l i t t l e a l k a l i n e s o i l i nn o r t h e r n C 盤i n aa n dt h eo p t i m a l p H r a n g ei s6 t o8 ．H o w e v e r ,a l u m i n u mt o x i c i t y p r

5、e v e n t s t h et r a n f e r o f a l f a l f ac u l t i v a t i o n t o t h e a c i d s o i l i n t h eL 0 n gR i v e rr e g i o na n d s o u t ha r e ao fC h i n a ．G e n e r a l l y , i n o r d e rt or e l i e v ea l

6、 u m i n u mt o x i c i t y , p e o p l eU S el i m et oi m p r o v e t h es o i lp H ．B u tt h i sm e t h o d c a n n o t s o l v et h es o i la c i d ，b e c a u s el i m eo n l yc a ni m p r o v e t h et o ps o i l ’s

7、p H ．n o ti m p r o v et h e d e e p e r s o i l 。S op e o p l et r y t os e e k a n e ww a y t o b r e e da l u m i n u m —t o l e r a n t c ea l f a l f a ．P r e s e n t l y ，w i t ht h e d e v e l o p m e n to f t h e

8、t r a n s g e n i c t e c h n o l o g y ，i ti s p o s s i b l et oi m p r o v e t h eq u a l i t i e so fa l f a l f ab y g e n e t i ce n g i n e e r i n g ．T o e n h a n c et h ea I n m i n o mt o l e r a n c eo ft h i

9、 sf o r a g el e g u m ef o rt h el a r g e ‘s c a l e p l a n t i n gi n s o u t h e r nC h i n a ，t h i ss t u d yc o n d u c t e dt h ef o l l o w i n gr e s e a r c hw o r k ．P r i m e r sw e r e d e s i g n e da c c

10、 o r d i n gt ot h en u c l e o t i d es e q u e n c e o fc i t r a t es y n t h a 辯沁) g e n e ．T h ee n d o n u c l e a s e r e c o g n i t i o ns i t eN e oI a n d X b a 1 w e r ea d d e d t of o r w a r d a n d r e v

11、e r s ep r i m e rr e s p e c t i v e l y ．T h ee D N A o fe sw a s a m p l i f i e df r o mt o b a c c ot o t a l 震^ 強v i a 霽r ·P C R a n dt h e ns u b c l o n ei n t op M D l 8 - T t oy i e l dp M D I & C S 。T

12、 oc o n s t r u c tt h el i g h ti n d u c i b l ep l a n te x p r e s s i o nv e c t o r , t h ep M D l 8 - C S v e c t o rw a sd i g e s t e dw i t hN c oI a n d X b a Ia n ds u b d o n e di n t ot h eD “ C - R b c s -

13、 3 e v e c t o rw h i c hc o n t a i n st h el i g h ti n d u c e dp r o m o t e r t or e p l a c et h et r a n s i tp e p t i d ea n d3 cg e n ef r a g m e n t s ．T h er e s u l t a n tp l a s m i dp U C - R b c s - c s

14、w a sd o u b l e - d i g e s t e dw i t h 掇l d l 玨，X b a { a n dt h et a g e tf r a g m e n tw a sl i g a t e d i n t ot h e 囂捷矗| l | ，X b a l s i t e s o fap l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp P Z P 2 1 1a n dg e n

15、e r a t e dap l a n tl i g h ti n d u c i b l ee x p r e s s i o nv e c t o r p P Z P 2 1 1 - r b c s - c s ．O n t h e o t h e r h a n d ，c s g e n e w a s a m p l i f i e d w i t h P r ) ，o b e s l D N A p o l y m e r a

16、 s e b y u s i n gp M D l 8 - C S a s at e m p l a t e ，B l u n tt e r m i n a lP C R p r o d u c tw a s l i g a t e di n t ot h eg a t e w a y e n t r yv e c t o rp E N T R ／D —T O P O ．A f t e ri d e n t i f i c a t i

17、o nb yr e s t r i c t i o n e n z y m e sa n dP C R ，t h ec o r r e c te n t r yc l o n e ，p E N T R ／D ·T O P O - C S ， w a s o b t a i n e d ． G a t e w a y L R r e a c t i o n w a s p e r f o r m e d w i t hp E N

18、 T I U D - T O P O ·C Sa n d t h e p l a n te x p r e s s i o nv e c t o rp B 2 G W 7 t o p r o d u c e 贏c o n s t i t u t i v ep l a n t，e x p r e s s i o n v e c t o rp B 2 - C S ，、A g r o b a c t e r i u mt u m e

19、 f a c i e n sC 5 8 C 1 ( p P M P 9 0 ) w a s t r a n s f o r m e d w i t hp P Z P 2 1 1 - r b c s —c g o rp B 2 一C S ．A l f a l f at r a n s f o r m a t i o nw a sp e r f o r m e d v i aA g r o b a c t e r i u m —m e d

20、i a t e dm e t h o d ．T h el e a v e sp r e p a r e df r o m t h eh i g h l yr e g e n e t a t i v es t e r i l ep t a n t l e t sw a s i n f e c t e da n dc o - c u l t i v a t e dw i t ht h eA g r o b a c t e r t u m t

21、 u m e ／a c i e n s ．弱犯c a l l u sw a s i n d u c e df r o m t h el e a v e sb u tt h et r a n s g e n i cA l a f a l f ap l a n t s a r en o t o b t a i n e da t p r e s e n t ，A t t h es a m e t i m e ，t o o b t a i nn

22、 e w s t r a t e g yf o r g e n e t i ce n g i n e e r i n g i n a l f a l f a f o ri m p r o v e m e n t o fi 拇A l —r e s i s t a n c e ．T h ee D N A w a s i s o l a t e df o rt h eg e n e sw h i c h d i s p l a y d i f