黃孢原毛平革菌降解楊木纖維素酶解木素相關(guān)機(jī)制的研究及白腐菌木素生物降解的應(yīng)用.pdf

1、復(fù)雜異質(zhì)的木素是自然界中最抗降解的生物聚合物，它保護(hù)纖維素和半纖維素免受微生物降解，因此木素的生物降解是陸生生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的限速步驟。另外，木素生物降解的研究有助于木質(zhì)纖維素原料生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展和生物修復(fù)的應(yīng)用。擔(dān)子菌綱的白腐真菌是木素最有效的降解者。Phanerochaete chrysosporium是木素白腐降解研究的主要白腐菌之一。已知參與其木素降解的組分包括多種木素降解酶，低分子量的糖肽，還原因子以及一些小分子物質(zhì)。但其降解

2、木素的機(jī)制尚不明確。
　　本論文采用兩條路線來研究P.chrysosporium降解楊木纖維素酶解木素(CEL)的機(jī)制，一條是利用純化的過氧化物酶構(gòu)建楊木CEL的體外降解系統(tǒng)，另一條是利用已經(jīng)申請專利的膜連裝置研究P.chrysosporium的菌絲體直接降解楊木CEL的胞外活性組分。首先，從楊木中制備了CEL，在P.chrysosporium產(chǎn)過氧化物酶優(yōu)化的條件下純化了木素過氧化物酶(LiP)和錳過氧化物酶(MnP)并探討了其

3、木素降解酶共高產(chǎn)的碳源。接著利用純化的LiP、MnP和吡喃糖2-氧化酶(P2O)進(jìn)行了楊木CEL體外降解系統(tǒng)構(gòu)建的實驗;在P.chrysosporium產(chǎn)過氧化物酶的優(yōu)化條件下，采用其木素降解酶共高產(chǎn)的最優(yōu)碳源，利用膜連裝置研究了P.chrysosporium降解楊木CEL的胞外活性組分。另外，針對實驗中的意外發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了考馬斯亮藍(lán)G-250測定堿溶木素濃度的研究。最后利用篩選到的選擇性降解的白腐菌-Trametes hirsuta l

4、g-9對玉米秸稈的全利用進(jìn)行了嘗試。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.楊木CEL的制備及考馬斯亮藍(lán)G-250測定堿溶木素的濃度
　　通過木片粉碎、脫脂、球磨磨解、纖維素酶酶解、1，4-二氧六環(huán)抽提、抽提液減壓濃縮、雙蒸水沉淀和凍干，得到粗CEL;進(jìn)一步通過90％醋酸溶解、雙蒸水對溶解液的沉淀、沉淀經(jīng)真空干燥、再溶解于1，2-二氯乙烷∶乙醇(2∶1)的混合溶劑、乙醚沉淀、石油醚清洗和真空干燥，得到精制的楊木CEL。對其

5、進(jìn)行表征的結(jié)果為4.77％殘?zhí)橇俊?.25％殘留蛋白質(zhì)、85.1％總木素含量、Mw=15075 g/mol、Mn=8595 g/mol。
　　初步研究發(fā)現(xiàn)考馬斯亮藍(lán)G-250(CBBG)試劑與堿溶楊木CEL和堿溶堿木素混合引起了最大吸收波長630 nm處吸光度值的增加，與堿溶木素磺酸鈉混合引起了最大吸收波長640 nm處吸光度值的增加。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)混合液在最大吸收波長處的吸光度值與堿溶木素濃度呈線性正相關(guān)。等溫滴定量熱實驗結(jié)果以及水

6、、4％乙醇和95％乙醇分別清洗的沉淀的紅外譜圖(FT-IR)對比分析顯示CBBG非共價結(jié)合堿溶木素。楊木硫酸鹽制漿黑液中木素濃度的測定顯示，與紫外光譜法相比，CBBG法的測定結(jié)果和K1ason木素更接近定量制備法。這種潛在的測定堿溶木素濃度的方法-CBBG法-可重復(fù)且快速簡單，此外它還不受碳水化合物降解產(chǎn)物的干擾。
　　2.Phanerochaete chrysosporium產(chǎn)過氧化物酶的優(yōu)化及其過氧化物酶的純化
　　接種

7、量、培養(yǎng)溫度和藜蘆醇濃度對P.chrysosporium產(chǎn)過氧化物酶影響的研究表明:低藜蘆醇濃度時，低接種量有利于LiP和MnP的產(chǎn)生，高藜蘆醇濃度時則高接種量有利于LiP和MnP的產(chǎn)生;30℃時，P.chrysosporium在第六天達(dá)到LiP的產(chǎn)酶峰值，39℃時，P.chrysosporium在第四天達(dá)到LiP的產(chǎn)酶峰值，且30℃較39℃更利于MnP的高產(chǎn);藜蘆醇濃度對產(chǎn)LiP影響存在LiP產(chǎn)量最高的臨界濃度-3 mM，對產(chǎn)MnP的

8、影響則表現(xiàn)為30℃培養(yǎng)時，低的藜蘆醇濃度有利于MnP的產(chǎn)生，39℃培養(yǎng)時，較高的藜蘆醇濃度則更有利于MnP的產(chǎn)生，但太高濃度的藜蘆醇不利于MnP的高產(chǎn)。為了分離純化LiP和MnP，選擇了短發(fā)酵周期的39℃作為發(fā)酵溫度，3mM的藜蘆醇添加入培養(yǎng)基，A650nm=0.65/cm的孢子懸浮液作為接種物進(jìn)行靜置發(fā)酵。收獲4天的胞外發(fā)酵液，經(jīng)超濾、Sephdex G-75的分子篩層析、超濾透析、Mono Q陰離子交換柱，純化得到H1、H2、H3、

9、H4、H6、H7、H8、H9和H109個組分。其中H1、H2、H6、H7、H8、H9和H10組分都具有LiP活性，同時H2還具有少量的MnP活性，H3和H4組分具有MnP活性，但還有微量的LiP活性。
　　3.過氧化物酶和吡喃糖2-氧化酶體外協(xié)同降解楊木CEL
　　H6-H9混合酶夜組成的LiP、H3和H4混合酶液組成的MnP和來自Irpex lacteusdft-1的P2O協(xié)同降解楊木CEL的研究，設(shè)計了三組系統(tǒng)。分別是P

10、系統(tǒng)、C系統(tǒng)和V系統(tǒng)。P系統(tǒng)為10 mL pH4.520 mM琥珀酸鈉緩沖溶液反應(yīng)體系，其中包含10 mg楊木CEL、3 IU LiP、4 IU MnP、0.3 IU P2O、0.15 IU滅活的過氧化氫酶、4μmol藜蘆醇、5μmol Mn2+、500μmol乳酸和500μmol葡萄糖;C系統(tǒng)除了滅活的過氧化氫酶由活性過氧化氫酶取代外，其它成分與P系統(tǒng)相同;V系統(tǒng)除了加入2μmol的維生素C外，其它成分與C系統(tǒng)相同。三個系統(tǒng)分別處理3

11、h、6h、12h和24 h。上清液的酶活測定和紫外光譜分析以及殘余固體楊木CEL的GPC結(jié)果顯示:三個系統(tǒng)上清液中溶解木素含量的增加隨著處理時間的延長，基本呈增加的趨勢;P系統(tǒng)中P2O產(chǎn)生的過量H2O2引起了LiP的失活，C系統(tǒng)中過氧化氫酶的加入微弱地恢復(fù)了LiP的活性，V系統(tǒng)中維生素C的加入進(jìn)一步恢復(fù)了其活性;過氧化物酶和P2O能夠有效地降解楊木CEL，過氧化氫酶微弱的增加了楊木CEL的降解，維生素C進(jìn)一步增強(qiáng)了楊木CEL的降解。

12、r>　　4.碳源對Phanerochaete chrysosporium產(chǎn)胞外木素降解酶的影響
　　調(diào)查了改變生長環(huán)境中的碳源對P.chrysosporium生產(chǎn)胞外木素降解酶的影響。葡萄糖、纖維二糖、纖維素以及其中兩兩的混合物分別作為碳源。監(jiān)測培養(yǎng)過程中木素降解酶的活性發(fā)現(xiàn):葡萄糖氧化酶和乙二醛氧化酶在整個培養(yǎng)過程中在所有碳源的培養(yǎng)基中均產(chǎn)生;高峰值的MnP活力(0.17-0.24 IU/mL)僅在包含寡糖的培養(yǎng)介質(zhì)中出現(xiàn);Li

13、P的活性在葡萄糖的介質(zhì)中具有高的水平(峰值活性為0.21IU/mL)，但在纖維素介質(zhì)中僅產(chǎn)生了微量的LiP(峰值活性為0.01 IU/mL);當(dāng)P.chrysosporium生長在包含纖維素的介質(zhì)上時，檢測到高的纖維二糖:醌氧化還原酶（峰值活性為3.33-3.99 IU/mL）和纖維二糖脫氫酶(峰值活性為0.04-0.2IU/mL)活性。這項調(diào)查表明在所調(diào)查的碳源中，P.chrysosporium利用葡萄糖和纖維素的混合物作為碳源更有利

14、于木素降解酶的共同高產(chǎn)。
　　5.Phanerochaete chrysosporium降解楊木CEL胞外活性組分的研究
　　將膜連裝置用于研究P.chrysosporium降解楊木CEL，P.chrysosporium被接種在Vessel A中，楊木CEL被放置在Vessel B中，即將P.chrysosporium的菌絲體與被降解的木素大分子在空間上隔開，排除了菌絲體吸附木素的干擾，同時安裝的膜并不完全阻隔P.chrys

15、osporium及其所分泌的胞外活性組分與木素大分子之間的相互作用。分別使用了安裝1 kDa、5 kDa和10 kDa膜的膜連裝置，通過VesselA和Vessel B上清液中酶活和低分子量物質(zhì)活性的測定發(fā)現(xiàn):P.chrysosporium在VesselA中所分泌的胞外酶中，除了LiP和MnP的活性可以透過1k、5k和10k的膜進(jìn)入Vessel B外，其它所檢測到的木素降解酶和纖維素酶的活力都不能透過1k、5k和10k的膜進(jìn)入Vesse

16、l B;還原Fe3+和產(chǎn)OH·活性源于P.chrysosporium培養(yǎng)過程中分泌的活性物質(zhì)，且小于1k的部分已經(jīng)具有還原Fe3+和產(chǎn)OH·的活性。VesselB中剩余的固體楊木CEL的GPC結(jié)果顯示:楊木CEL的降解程度隨著膜連裝置中膜孔徑的增加而增加。實驗組、對照A和對照B的Vessel A和Vessel B的上清液LC-MS/MS的對比分析發(fā)現(xiàn):在實驗組的Vessel A中P.chrysosporium產(chǎn)生了一些化合物，它們在質(zhì)譜

17、中具有最大分子量700-1000左右的片段;這些化合物在對照A的Vessel A和實驗組的Vessel B上清液中均未出現(xiàn)，可能是P.chrysosporium降解楊木CEL的關(guān)鍵組分。
　　6.白腐菌木素降解用于玉米秸稈全利用的一種方式
　　T.hirsuta lg-9是從9種菌株中篩選出的選擇性降解玉米秸皮能力最強(qiáng)的菌株。該菌株被用于處理玉米秸皮(CSR)，接著被精磨成紙漿。菌株的生物處理引起了紙漿所抄造的紙張強(qiáng)度和白度

18、的下降，但精磨中的能耗(ECR)降低。ECR與菌株處理過程的酶活、菌株處理后玉米秸皮的得率(Y)和菌株處理后玉米秸皮紅外光譜上的相對吸收強(qiáng)度的Pearson相關(guān)分析顯示:當(dāng)顯著性水平α=0.1，Y、生物處理后玉米秸皮紅外譜圖上3414 cm-1處的相對吸光度值(A3414)和1653 cm-1處的相對吸光度值(A1653)與ECR有高的線性相關(guān)，且ECR與Y和A3414呈正相關(guān)，與A1653呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步，ECR作為因變量，Y、A34