棉花葉片和纖維蔗糖磷酸合成酶活性變化及其基因的克隆分析.pdf

1、在豐抗6號(hào)、中棉45和山農(nóng)棕02三個(gè)品種(系)發(fā)育的花鈴期，測(cè)定它們倒一果枝第一果節(jié)的葉片和棉纖維中蔗糖含量、可溶性糖含量和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性的變化，利用電子克隆的方法，克隆了SPS基因片段，分析SPS基因mRNA水平上的表達(dá)量的變化，并對(duì)克隆的SPS基因編碼氨基酸序列進(jìn)行分析，獲得結(jié)果如下： 1.三個(gè)品種(系)的SPS酶活性的變化在葉片和棉纖維發(fā)育過程中均出現(xiàn)雙峰，高峰值出現(xiàn)在開花當(dāng)天和花后18天，這兩個(gè)峰值是前者大

2、于后者，且整體變化均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。SPS酶活性在豐抗6號(hào)最高，其次為中棉45，山農(nóng)棕02最低。三個(gè)品種(系)的可溶性總糖含量、蔗糖含量表現(xiàn)同樣的變化規(guī)律。 2.棉花葉片中SPS酶的活性要比棉纖維中的活性高，這說明SPS參與合成蔗糖主要發(fā)生在葉片中；在棉纖維次生壁沉淀期(即花后18天)棉纖維中的SPS酶活性的提高，這說明SPS在棉纖維次生壁合成時(shí)也起一定的作用。 3.利用RT-PCR技術(shù)，分析了花鈴期棉花葉片和棉纖維SPS

3、基因片段在轉(zhuǎn)錄水平上的變化，結(jié)果表明三個(gè)品種(系)葉片的SPS基因的表達(dá)量要高于棉纖維中的表達(dá)量，葉片SPS基因的表達(dá)量高，棉纖維的SPS的表達(dá)量低，這說明SPS基因主要在作為“源”的葉片中起作用。在葉片和棉纖維中，SPS基因片段的表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄水平上從高到低依次為：豐抗6號(hào)、中棉45和山農(nóng)棕02。 4.利用電子克隆的方法，克隆了棉花SPS基因片段，共1050bp，命為電子克隆拼接序列(e-cloning)。根據(jù)拼接的SPS基因片

4、段，設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)，獲得SPS基因片段，經(jīng)測(cè)序共980bp，命為測(cè)序片段(cexu)。電子克隆拼接序列與棉花實(shí)際克隆核苷酸序列相似性為80％，氨基酸序列相似性為75％，cexu的氨基酸序列與其他植物溫州蜜桔、蠶豆、馬鈴薯、車前菊、甜菜、菠菜的SPS氨基酸序列相似性在60％-68％之間，并且有共同的保守區(qū)域，這些高度保守的氨基酸序列可能是SPS基因的活性位點(diǎn)。 5.生物信息技術(shù)分析表明已克隆的SPS基因片段包含320個(gè)氨

5、基酸，分子量為36525.4，理論等電點(diǎn)pI為6.00，不穩(wěn)定指數(shù)估算值為56.93，屬于不穩(wěn)定蛋白類。其中極性氨基酸占56％，疏水氨基酸占44％。該基因片段編碼氨基酸的高級(jí)結(jié)構(gòu)為混合類型，呈螺旋狀的氨基酸殘基占20.38％，呈折疊狀的氨基酸殘基占31.75％，呈環(huán)狀的氨基酸殘基占47.87％。第43和第114位上結(jié)合二硫鍵的可能性最大，預(yù)測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)可能對(duì)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定有重要作用。預(yù)測(cè)SPS酶基因片段編碼氨基酸序列有兩個(gè)跨