棉花液泡h39;atpasec亞基基因ghdet3的克隆與功能分析

1、西南大學碩士學位論文棉花液泡H-ATPase C亞基基因GhDET3的克隆與功能分析姓名：肖忠意申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：羅明20080501摘要( A b s t r a c t )中文捅要棉花是世界上一種重要的纖維作物。棉花纖維是棉花胚珠表面突起分化出的單個細胞，能夠快速伸長并且進行次生壁的合成。棉花纖維的發(fā)育過程分為四個階段，包括纖維細胞起始、纖維細胞伸長、次生壁合成和脫水成熟。其中在纖維快速伸長時期纖

2、維細胞的每天伸長速度最快可以達到2 ．O m m o 纖維的長度是纖維品質的一個重要指標，同時也是一個對纖維產(chǎn)量具有重要權重的農(nóng)藝性狀。因此，纖維細胞的伸長對成熟纖維的最終長度具有決定作用。傳統(tǒng)育種方法曾經(jīng)為棉花產(chǎn)量和品質的提高做出了巨大貢獻，但利用傳統(tǒng)育種方法難以打破纖維產(chǎn)量和品質的負相關，難以達到產(chǎn)量和品質的同步提高。基因工程可以實現(xiàn)目標性狀的定向改良，但需要了解纖維發(fā)育的分子機理和獲得相關的目標基因以及適宜的啟動子。由于棉花分子生

3、物學的研究的時間尚短，所以目前對棉花纖維伸長的主要機制還不清楚。因此，克隆和了解棉花纖維細胞起始和伸長相關的關鍵基因，探索纖維伸長的分子機制，將為利用基因工程改良棉花纖維提供理論基礎和轉基因材料。植物激素是指在植物體內合成的、對植物生長具有顯著調節(jié)作用的微量有機物質。油菜素類固醇類物質是第六大植物激素。外施油菜素內酯能促進植物生長，達到增產(chǎn)增質效果。雖然前人發(fā)現(xiàn)棉花纖維細胞中B R s 合成酶基因在纖維起始和伸長過程中具有重要作用，在棉

4、花纖維中超量表達B 黜合成酶基因能夠改良纖維數(shù)量和質量，但是目前尚未見通過轉基因棉花手段了解B 風信號途徑基因對棉花纖維細胞起始和伸長的影響的報道。因此，從B 飚信號途徑基因探索棉花纖維發(fā)育的分子機制具有重要的意義，對培育新的棉花品種具有重大的潛力。液泡曠仰勰e 具有夠調節(jié)細胞的滲透壓的功能，并且由于其在纖維伸長時期的酶活性最高，因此前人認為V 二A r P 弱e 能夠調節(jié)對棉花纖維的生長和發(fā)育。D E 乃基因編碼V 二A 皿弱eC 亞

5、基基因，對V - A T P 勰e 的酶活性具有重要的調節(jié)作用，D E 刀基因的缺失突變體表現(xiàn)為B 心缺失的典型性狀，卻對外施B R s 不敏感，因而認為D E T 3 介導了B 飚信號途徑的快速反應途徑，從而促進的細胞伸長。為了了解v ．A T P a ∞C 亞基基因棉花纖維發(fā)育的影響，本實驗克隆了棉花液泡礦．A T P a S eC 亞基基因( 眺乃) ，并對基因序列和表達特征進行了分析，然后利用轉基因煙草和棉花分析了G 矗腳乃基因

6、的功能。主要結果如下：一、鋤D E 乃基因克隆和表達分析通過A t D E T 3 探針在N C B I 數(shù)據(jù)庫中篩選和整合相關E s T 序列，并利用3 ’．R A C E 克隆了G 加E 乃基因的3 ’一端序列，并最終獲得了G —杞匠乃的c D N A 和g D N A 序列。該基因氨基酸序列與其它物種的同源分析結果表明G l l D E T 3 與擬南芥、水稻、苜蓿、大麥和玉米等物種的v ．A T P 舔e C 亞基有較高的同源性

7、。G h D E T 3 的一級結構具有v ．A 皿夠e C 亞基保守結構域，且其三級結構與酵母同源蛋白質的三級結構高度相似。Q u 鋤t i t a t i v er e a l ．t i m e P C R 分析各個組織和器官中G 庇腳乃基因的表達特征，結果表明G 址) E 乃基因在所有受測組織和器官中均有表達，但是在不同組織和器官中表達存在明顯差異。在基本組織中，G 址) E 乃基因在下胚軸中的表達水平較高，而在子葉和成熟葉片中的