蛇足石杉離體葉狀體生產(chǎn)石杉堿甲的工藝條件研究.pdf

1、本研究以廬山野生蛇足石杉莖尖離體誘導出具有代謝石杉堿甲(抗老年癡呆癥藥物)能力的葉狀體為研究對象，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件及石杉堿甲提取工藝，篩選出高產(chǎn)石杉堿甲葉狀體株系?；A培養(yǎng)基篩選設計（B5、6，7-V，MS、N6、White）；用正交實驗對植物生長物質濃度進行篩選；蔗糖用量（g/L）設計為10、15、20、25、30。光照條件設計為不同光質（紅光、白光、藍光），光照時間（12 h/d，14 h/d），光照強度(0lx、1000 lx、1

2、500 lx、2000 lx)。石杉堿甲提取工藝設計為：酒石酸浸泡培養(yǎng)物干粉時間（12 h、18 h、24 h、30 h、36 h）；酒石酸浸泡培養(yǎng)物干粉體積（10 mL、20 mL）。采用薄層層析及高效液相色譜法對石杉堿甲進行定性定量檢測。用 Logistic模型擬合葉狀體的生長曲線模型；通過POD酶考察其培養(yǎng)過程中相關遺傳物質的穩(wěn)定性。從而為蛇足石杉離體培養(yǎng)產(chǎn)石杉堿甲技術提供一定的理論基礎，本實驗研究結果如下：
　　1.在植物

3、離體培養(yǎng)技術中，培養(yǎng)基配方是細胞增殖的主要因素，本實驗結果表明不加激素的1/4 MS+20 g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基是葉狀體的最佳增殖培養(yǎng)基。
　　2.光調控是植物離體培養(yǎng)生長及合成次級代謝物至關重要的因素，本試驗結果表明：以白光為主要光源，光照時間為12 h/d，光照強度1500 lx左右的條件是葉狀體增殖產(chǎn)石杉堿甲的最佳光照條件，相對增殖率達到3174.5％，石杉堿甲累積量達到72.45 ug/L。
　　3.本試驗優(yōu)化的石

4、杉堿甲提取工藝：2%酒石酸浸泡24 h，超聲30 min，重復三次，氯仿萃取5次，自然風干后甲醇提純。篩選出氯仿/丙酮/異丙醇/氨水（4:4:2:0.1，v/v/v/v）薄層層析效果最好；分離效果最佳的高效液相色譜條件：流動相為甲醇-醋酸銨（0.08 mol/L;pH=6）=3:7，流速:0.8 mL/min，檢測波長:308 nm，柱溫:25℃，進樣量：20μL。
　　4.在培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎上，探索了葉狀體增殖及合成石杉堿甲的

5、動力學，蛇足石杉離體葉狀體增殖的生長曲線呈“S”形，繼代周期以50 d左右為最適；60 d后生長進入穩(wěn)定階段，累積石杉堿甲明顯加快，直至85 d達到最大值7.453 ug/g，即葉狀體先快速增殖，后累積石杉堿甲。葉狀體累積石杉堿甲與葉狀體增殖成非生長偶聯(lián)型，葉狀體增長規(guī)律符合Logistic生長模型，最大的比生長速率（umax）為0.071/d。
　　5.分析不同生長階段的葉狀體POD同工酶色譜圖，得出葉狀體在生長過程中POD酶沒