蛇足石杉離體葉狀體生產(chǎn)石杉?jí)A甲的工藝條件研究.pdf

1、本研究以廬山野生蛇足石杉莖尖離體誘導(dǎo)出具有代謝石杉?jí)A甲(抗老年癡呆癥藥物)能力的葉狀體為研究對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)條件及石杉?jí)A甲提取工藝，篩選出高產(chǎn)石杉?jí)A甲葉狀體株系?；A(chǔ)培養(yǎng)基篩選設(shè)計(jì)（B5、6，7-V，MS、N6、White）；用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)植物生長(zhǎng)物質(zhì)濃度進(jìn)行篩選；蔗糖用量（g/L）設(shè)計(jì)為10、15、20、25、30。光照條件設(shè)計(jì)為不同光質(zhì)（紅光、白光、藍(lán)光），光照時(shí)間（12 h/d，14 h/d），光照強(qiáng)度(0lx、1000 lx、1

2、500 lx、2000 lx)。石杉?jí)A甲提取工藝設(shè)計(jì)為：酒石酸浸泡培養(yǎng)物干粉時(shí)間（12 h、18 h、24 h、30 h、36 h）；酒石酸浸泡培養(yǎng)物干粉體積（10 mL、20 mL）。采用薄層層析及高效液相色譜法對(duì)石杉?jí)A甲進(jìn)行定性定量檢測(cè)。用 Logistic模型擬合葉狀體的生長(zhǎng)曲線模型；通過(guò)POD酶考察其培養(yǎng)過(guò)程中相關(guān)遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。從而為蛇足石杉離體培養(yǎng)產(chǎn)石杉?jí)A甲技術(shù)提供一定的理論基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下：
　　1.在植物

3、離體培養(yǎng)技術(shù)中，培養(yǎng)基配方是細(xì)胞增殖的主要因素，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不加激素的1/4 MS+20 g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基是葉狀體的最佳增殖培養(yǎng)基。
　　2.光調(diào)控是植物離體培養(yǎng)生長(zhǎng)及合成次級(jí)代謝物至關(guān)重要的因素，本試驗(yàn)結(jié)果表明：以白光為主要光源，光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度1500 lx左右的條件是葉狀體增殖產(chǎn)石杉?jí)A甲的最佳光照條件，相對(duì)增殖率達(dá)到3174.5％，石杉?jí)A甲累積量達(dá)到72.45 ug/L。
　　3.本試驗(yàn)優(yōu)化的石

4、杉?jí)A甲提取工藝：2%酒石酸浸泡24 h，超聲30 min，重復(fù)三次，氯仿萃取5次，自然風(fēng)干后甲醇提純。篩選出氯仿/丙酮/異丙醇/氨水（4:4:2:0.1，v/v/v/v）薄層層析效果最好；分離效果最佳的高效液相色譜條件：流動(dòng)相為甲醇-醋酸銨（0.08 mol/L;pH=6）=3:7，流速:0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):308 nm，柱溫:25℃，進(jìn)樣量：20μL。
　　4.在培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，探索了葉狀體增殖及合成石杉?jí)A甲的

5、動(dòng)力學(xué)，蛇足石杉離體葉狀體增殖的生長(zhǎng)曲線呈“S”形，繼代周期以50 d左右為最適；60 d后生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定階段，累積石杉?jí)A甲明顯加快，直至85 d達(dá)到最大值7.453 ug/g，即葉狀體先快速增殖，后累積石杉?jí)A甲。葉狀體累積石杉?jí)A甲與葉狀體增殖成非生長(zhǎng)偶聯(lián)型，葉狀體增長(zhǎng)規(guī)律符合Logistic生長(zhǎng)模型，最大的比生長(zhǎng)速率（umax）為0.071/d。
　　5.分析不同生長(zhǎng)階段的葉狀體POD同工酶色譜圖，得出葉狀體在生長(zhǎng)過(guò)程中POD酶沒(méi)