Construction and investigaton of targeting DNA nanocarriers.pdf

1、DNA納米技術(shù)是一個(gè)新興的、令人興奮的領(lǐng)域，代表著生物醫(yī)學(xué)的前沿領(lǐng)域。互補(bǔ)堿基對(duì)之間相互作用的特異性使得DNA成為既可編程又具有靈活性的、可構(gòu)建二維或三維結(jié)構(gòu)的材料，即 DNA折紙材料。DNA材料獨(dú)特的分子線性結(jié)構(gòu)、自我識(shí)別能力和納米尺度，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的給藥系統(tǒng)?？鼓[瘤藥物阿霉素（DOX）含有蒽環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠嵌入到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中并形成穩(wěn)定的復(fù)合物，本研究利用DNA折紙的性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)靶向治療、生物作用和化學(xué)治療作用聯(lián)合應(yīng)用的目的

2、，從而提高阿霉素的抗腫瘤作用。
　　研究目的：
　　將環(huán)狀單鏈DNA經(jīng)折紙術(shù)制備成可靶向到淋巴瘤細(xì)胞的DNA矩形片折紙載體，提高阿霉素的抗腫瘤作用，降低其副作用；將具有生物活性的適配體C2NP修飾到折紙載體上，精準(zhǔn)靶向腫瘤部位，載藥后使其同時(shí)發(fā)揮化學(xué)治療作用和生物治療作用。
　　研究方法：
　　用PCR儀將環(huán)狀單鏈DNA（M13mp18）和相應(yīng)的訂書(shū)釘單鏈DNA合成DNA矩形片折紙結(jié)構(gòu)，利用DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)原則

3、將核酸適配體C2NP修飾到矩形片折紙結(jié)構(gòu)上，制備出靶向淋巴瘤細(xì)胞的折紙載體；通過(guò)改變與適配體互補(bǔ)的訂書(shū)釘單鏈 DNA的數(shù)目和位置以?xún)?yōu)化折紙載體上靶頭的位置和數(shù)目。用凝膠電泳和原子力顯微鏡對(duì)載體進(jìn)行表征，并對(duì)載體的載藥條件進(jìn)行優(yōu)化，確定藥物與載體的最佳孵育濃度比和孵育時(shí)間。用酶標(biāo)儀測(cè)定DOX的熒光強(qiáng)度，對(duì)載藥系統(tǒng)的載藥量及體外釋放情況進(jìn)行考察。使用CCK-8法考察折紙載藥系統(tǒng)對(duì)Karpas299細(xì)胞的增殖抑制作用、生物療效以及生物治療和化

4、療聯(lián)合作用；用流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞對(duì)載藥體系的定性、定量攝取以及進(jìn)入細(xì)胞的位置。使用試劑盒考察折紙載藥系統(tǒng)與K299細(xì)胞作用的細(xì)胞凋亡機(jī)制、細(xì)胞周期情況以及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
　　研究結(jié)果：
　　構(gòu)建了能夠靶向淋巴瘤細(xì)胞的DNA折紙載體；載體載藥后能夠提高阿霉素的穩(wěn)定性并延緩其釋放，平均每對(duì)堿基對(duì)之間可以插入一個(gè)阿霉素分子，一個(gè)DNA矩形片折紙約載入7000個(gè)阿霉素分子。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，折紙載體對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性

5、，不能夠穿過(guò)細(xì)胞核孔，只能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。折紙載體載藥后，明顯提高了DOX對(duì)K299細(xì)胞的增殖抑制作用，與細(xì)胞作用2h時(shí)，細(xì)胞對(duì)游離阿霉素的攝取量為4.43％，對(duì)連接四個(gè)靶頭和十六個(gè)靶頭的折紙載藥體系的攝取量分別為30.23%和56.84%；在生物治療方面，經(jīng)過(guò)修飾的C2NP靶頭明顯地提高了對(duì)K299細(xì)胞的增殖抑制作用；載藥后，在阿霉素低濃度時(shí)，載藥體系同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)K299細(xì)胞的生物作用和化療作用，在阿霉素高濃度時(shí)，生物作用受到抑制，主要

6、表現(xiàn)為化學(xué)治療作用。作用48h后，與游離阿霉素相比，折紙載藥系統(tǒng)明顯提高了K299細(xì)胞的凋亡率，由37.4%提高到62.1%，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，載藥系統(tǒng)能夠阻滯細(xì)胞周期的S期，進(jìn)而使細(xì)胞的分裂增殖受到抑制。
　　研究結(jié)論：
　　本課題成功構(gòu)建了DNA靶向載藥體系，載藥后能夠提高藥物的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，增強(qiáng)藥物的抗腫瘤作用；將適配體修飾到折紙載體上后能夠提高適配體的穩(wěn)定性、降低適配體