3-羥基丙酸合成過程中關鍵途徑的構建及優(yōu)化.pdf

1、3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）是乳酸的羥基異構體，是合成很多醫(yī)藥化工中間體的重要前體物質，具有廣泛的應用前景。但目前生物法利用甘油合成3-HP最主要的問題是其產量還未達到工業(yè)化水平，因此構建性能優(yōu)良的基因工程菌株是目前的主要研究方向。本研究以大腸桿菌Escherichia Coli BL21(DE3)為出發(fā)菌株，構建了合成3-HP的代謝路徑，引入了甘油脫水酶再激活因子GDR和輔酶NAD+再生途徑

2、，并在基因組上為合成乙酰CoA的基因acs更換了trc強啟動子，最后對構建的基因工程菌發(fā)酵生產3-HP能力進行了考察，具體研究內容如下:
　　1.克隆來源于Klebsiella pneumoniae DSM2026甘油脫水酶基因dhaB及再激活因子基因gdrA，采用不同的表達載體構建了重組質粒pETDuet-dhaB1-4、pET28a-dhaB1-4和口pCDFDuet-dhaB1-4;E.coli BL21(DE3)(pET-

3、28a-dhaB1-4/pETDuet-dhaB1-4/pCDFDuet-dhaB1-4)甘油脫水酶酶活依次為11.56U/mg、7.94U/mg和6.94U/mg。同時克隆表達來自Cupriavidus necator的醛脫氫酶基因GabD4，得到重組質粒pCDFDuet-tac-GABab D4。與實驗室前期構建的含有Azospirillum brasilense的內源性基因α-酮戊二酸半醛脫氫酶的重組質粒pCDFDuet-tac-

4、Tukgsadh比較，酶活分別為E.coli BL21(DE3)pCDFDuet-tac-TUkgsadh:3.11U/mg,E.coli BL21(DE3)pCDFDue-tac-GabD4:1.71U/mg。共表達得到工程菌株E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pET-28a-dhaB1-4)、E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-dh

5、aB1-4)、E.coli BL21(DE3)(pCDFDue-tac-GabD4/pET28a-dhaB1-4)和E.coliBL21(DE3)(pCDFDuet-tac-GabD4/pETDuet-dhaB1-4)。在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)38h，3-HP的最高產量分別為0.37g/L、1.14g/L、0.31g/L和0.86g/L。說明使甘油脫水酶和醛脫氫酶分別在不同拷貝數的質粒上表達來平衡二者的酶活，更適合3-HP的合成。

6、　　2.為提高3-HP的產量，進一步優(yōu)化了其合成途徑，包括甘油脫水酶再激活因子和輔酶NAD+再生途徑的引入以及乙酰CoA啟動子的更換?？寺碓从贙.pneumoniae DSM2026中的甘油脫水酶再激活因子基因gdrB，構建了E.coli BL21(DE3)(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB)，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)38h后3-HP產量提高到5.12g/L，相較之前提高了4.5倍

7、。與前期構建的輔酶再生的串聯重組質粒pCDFDuet-tac-gpd1-TUkgsadh和pCD FDuet-tac-sthA-TUkgsadh共表達后，搖瓶發(fā)酵38h后，結果顯示添加了輔酶再生基因后的工程菌，3-HP的產量反而降低，通過分析發(fā)現3-HP產量降低的主要原因是表達sthA和gpd1兩個基因后，由于代謝途徑中氧化還原力的不平衡導致途徑中缺乏NAD+，從而降低了醛脫氫酶的活性。除此之外，乙酰CoA合成過程中可以通過三羧酸循環(huán)經

8、氧化磷酸化釋放出大量的ATP供細胞生長和物質合成，因此本實驗采用CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)將合成乙酰CoA基因acs的啟動子替換為trc強啟動子，構建了E.coli BL21(DE3)T(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB)，該工程菌株發(fā)酵培養(yǎng)38h后，3-HP產量達到5.5g/L，菌株生長狀況良好，提前達到了穩(wěn)定期。
　　3.以工程菌E.coli BL21(DE3)T

9、(pCDFDuet-tac-TUkgsadh/pETDuet-tac-dhaB-gdrAB)為出發(fā)菌株，優(yōu)化了5L發(fā)酵罐中3-HP的發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中控制pH穩(wěn)定在7.0，3-HP產量為8.79g/L，比pH不控制的情況提高了68％。在pH恒定為7.0的基礎上，在甘油濃度下降至15g/L時開始添加，并維持甘油濃度在15-20g/L之間，發(fā)酵結束后3-HP產量達到12.11g/L。相比未補加甘油提升了38％。在此基礎上每隔12小時補加一