X射線輻照對小鼠睪丸組織中RNF146表達的影響及機制研究.pdf

1、電離輻射對男性生殖健康的影響，已受到了廣泛關注。睪丸作為對電離輻射高度敏感的器官，在接受一定劑量以上的電離輻射后會出現(xiàn)不同程度的結構和功能損傷，引起精子發(fā)生障礙，健康精子數(shù)量顯著減少，從而形成暫時甚至永久不育[1]。目前普遍認為精原細胞損傷是睪丸接受一定劑量以上射線輻照后生精障礙的重要原因[2]，因此，闡明電離輻射所致精原細胞損傷的分子機制，有助于深入理解睪丸輻射損傷的發(fā)生機理。
　　前期研究中我們發(fā)現(xiàn)了一種特異性表達于小鼠睪丸組

2、織的E3泛素連接酶—RNF146。泛素化是一種廣泛存在于真核生物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，不同的E3泛素連接酶能夠作用于不同的蛋白底物，催化特定的氨基酸殘基被泛素分子標記，進而被蛋白酶體識別，特異性降解[3]。RNF146作為一種DNA損傷反應蛋白，序列高度保守[4]。研究提示，RNF146能夠特異性識別結合凋亡誘導因子（apoptosis induc ing factor，AIF），促進AIF發(fā)生泛素化修飾，進而在胞質(zhì)中誘導其降解，修

3、復各種因素引起的DNA損傷，抑制細胞的凋亡[5]。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)RNF146的表達水平與小鼠性腺發(fā)育密切相關，在新生小鼠睪丸組織中RNF146表達極低，隨著性發(fā)育其表達水平迅速升高[4]。組織病理學研究顯示睪丸組織中RNF146主要定位于精原細胞和精母細胞中。RNF146在DNA復制非常活躍的睪丸組織中高表達的意義是什么？大劑量X線輻照后睪丸組織中RNF146表達下調(diào)對睪丸功能的影響如何？其分子機制是什么？
　　上

4、述問題的回答，有助于我們深入理解RNF146在睪丸輻照損傷進程中的作用和意義。為此，我們進行了下列兩部分研究工作：
　　第一部分：X射線輻照對小鼠睪丸損傷及RNF146表達的影響
　　目的：
　　觀察不同劑量X射線輻照對正常小鼠睪丸組織形態(tài)和功能以及RNF146表達的影響。
　　方法：
　　取成年雄性C57小鼠240只，隨機分為6組，每組40只，分別給予0、0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 Gy X射

5、線輻照，通過HE染色觀察不同劑量X射線輻照后16h、48h及45d小鼠睪丸組織形態(tài)變化；Tunel染色評價X射線輻照后16 h及48 h小鼠睪丸生精細胞的凋亡情況；q-PCR實驗檢測RNF14616h和48h mRNA的表達；45d后雄鼠與雌鼠1∶2合籠，根據(jù)輻照后雄鼠致正常雌鼠的受孕情況評價輻照對小鼠生育能力的影響。取成年雄性C57小鼠50只，隨機分為5組：Blank，2Gy16h，2Gy48h，4Gy16h以及4Gy48h，每組10

6、只。所有小鼠全部摘取左側睪丸，-80℃凍存，術畢1周后分別給予0、2、4 Gy X射線輻照，輻照后16h和48h取小鼠右則對應睪丸，Western-blot分析評價X射線輻照對小鼠睪丸組織中RNF146蛋白表達的影響。
　　結果：
　　HE染色結果顯示，X射線輻照后16h，各組睪丸組織無明顯形態(tài)學改變；輻照后48h，1Gy組可見胞核深染、固縮及碎裂，2Gy以上劑量組睪丸組織出現(xiàn)生精細胞形態(tài)異常，數(shù)量減少；45天后2Gy以下輻

7、射劑量睪丸組織組織形態(tài)變化不大，2Gy有明顯損傷，4Gy睪丸生精小管有嚴重的空管，管腔皺縮變小。合籠結果提示2Gy及以下輻射損傷對小鼠生育能力無明顯影響，4Gy輻照后小鼠生育能力顯著降低。Tunel染色提示4Gy射線輻照后睪丸細胞凋亡主要發(fā)生于外層的精原細胞及精母細胞。q-PCR、Western-blot實驗表明2Gy和4Gy射線輻照后48h RNF146表達水平整體出現(xiàn)下降趨勢。
　　結論：
　　小鼠在接受2Gy以上劑量的

8、X射線輻照后睪丸組織會出現(xiàn)損傷，且短期內(nèi)無法修復，4Gy輻照后損傷嚴重，雄性小鼠絕育率高達96%，射線輻照誘導生精細胞凋亡，同時伴隨著RNF146表達下調(diào)。
　　第二部分：X射線輻照誘導小鼠精原細胞GC1凋亡及凋亡誘導因子AIF核轉(zhuǎn)位
　　目的：
　　本實驗以GC1小鼠精原細胞為細胞模型，研究X射線輻照所引起的GC1小鼠精原細胞的凋亡及凋亡誘導因子（AIF）細胞定位的變化。
　　方法：
　　將對數(shù)生長期的精

9、原細胞細胞株GC1，分別接種至培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板中，分別給予0、3、6、9 Gy X射線輻照，通過溴脫氧尿苷（BrdU）摻入實驗檢測輻射對細胞增殖速率的影響；輻射后48 h，4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色觀察細胞核凝集情況，免疫熒光細胞化學染色檢測證胞質(zhì)及胞核中AIF蛋白定位的變化，Western blot分析細胞總蛋白、胞質(zhì)蛋白及核提取物中AIF蛋白的水平、RNF146總蛋白的變化以及二者表達水平的相關性；通過慢病毒過表達

10、GC1細胞中的RNF146，給予9Gy射線輻照，Western blot檢測驗證RNF146對AIF定位的影響。
　　結果：
　　隨著輻射劑量的增加，GC1細胞增殖速率顯著減慢，細胞活性降低。6Gy及9Gy X射線輻照后全細胞提取物中AIF蛋白總量變化不大，但細胞核提取物中AIF顯著增多，即AIF出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象。RNF146隨著射線劑量的增加表達降低，9Gy輻照組最明顯。過表達RNF146后，能夠抑制AIF的核轉(zhuǎn)位。