RNF146在非小細胞肺癌中的表達及其調(diào)節(jié)肺癌增殖侵襲機制研究.pdf

1、目的：
　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和死亡率已躍居各類惡性腫瘤的首位，而非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的75-80％。目前肺癌的治療效果及肺癌患者的長期生存率仍不盡人意。肺癌發(fā)展進程中多種因子的激活、抑制、相互協(xié)同或拮抗均對肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。因此，尋找肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程中的有用的生物學標記物，揭示肺癌新的治療靶點是目前腫瘤分子生物學研究的熱點。
　　E3泛素連接酶能夠調(diào)節(jié)多種細胞功能，如細胞增

2、殖、細胞周期阻滯和細胞凋亡等。一些E3泛素連接酶及其相關的泛素網(wǎng)的失調(diào)通常與人類疾病有關，特別是腫瘤和神經(jīng)退行性疾病。E3泛素連接酶可以是癌基因，也可以是抑癌基因，主要取決于它們所降解的靶蛋白是抑癌蛋白還是促癌蛋白。許多含有RING-finger結(jié)構(gòu)域的蛋白都擁有泛素連接酶活性，其中有些參與了腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移。
　　RNF146(RING finger protein146)基因定位于人類染色體6q22，33上。其蛋白含有WWE和

3、N末端RING finger結(jié)構(gòu)域，被鑒定是一種E3泛素連接酶。研究發(fā)現(xiàn)，RNF146通過與PAR結(jié)合而抑制Parthanators，具有神經(jīng)保護作用。RNF146還能夠促進DNA修復，防止DNA損傷性藥物或γ射線誘導的細胞死亡。在細胞損傷之后，RNF146能轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，促進參與DNA損傷修復的各種核蛋白的泛素化和降解。更重要的是，RNF146能夠作為PAR核糖基化調(diào)控下的E3泛素連接酶，調(diào)節(jié)tankyrase依賴的axin的降解，從而

4、正向調(diào)節(jié)Wnt信號通路。
　　Wnt信號轉(zhuǎn)導通路與肺癌的轉(zhuǎn)移、擴散、復發(fā)密切相關，是在肺癌細胞和已擴散肺癌細胞中保持高活性的通路。Wnt信號轉(zhuǎn)導通路激活后可增加肺癌細胞轉(zhuǎn)移和增殖的能力。Wnt通路可以通過多種機制異?；罨?，其主要功能是抑制磷酸化調(diào)控下的β-catenin的蛋白水解。從APC/Axin/GSK-3β/β-catenin降解復合體中被釋放的β-catenin能夠進入細胞核，激活Wnt的靶基因。在這一過程中Axin作為一

5、種構(gòu)架蛋白參與β-catenin降解復合體的形成，其穩(wěn)定性至關重要。Tankyrase(PARP5)能夠催化PAR轉(zhuǎn)移至Axin的殘基上，導致Axin的PAR核糖基化。RNF146能夠通過自身的PAR結(jié)合域與PAR核糖基化的Axin結(jié)合，然后發(fā)揮其E3連接酶的作用，降解Axin，從而引起β-catenin降解復合體的解散，胞質(zhì)內(nèi)β-catenin聚集，促進Wnt信號通路。之前的研究已經(jīng)證明Axin與肺癌的侵襲和增殖能力密切相關，因此我們

6、推測，RNF146可能通過調(diào)節(jié)Axin的穩(wěn)定性而影響肺癌中β-catenin的表達與定位，從而對肺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。
　　為了證實我們的推測，我們首先采用RT-PCR、Western-Blot和免疫組織化學方法檢測手術切除的肺癌和癌旁肺組織中RNF146的表達水平及其與臨床病理因素和肺癌預后的關系、并分析RNF146與Axin和β-catenin表達的相關性。然后在人非小細胞肺癌細胞系中轉(zhuǎn)染RNF146過表達或者干

7、擾質(zhì)粒，通過上調(diào)或干擾RNF146檢測肺癌細胞中Axin和β-catenin的變化，以及上調(diào)和干擾RNF146后對肺癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，并探討其可能的分子機制。
　　方法：
　　1、組織來源
　　133例NSCLC肺癌組織和40例癌旁肺組織石蠟標本來自2005年1月至2008年12月在中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院行外科手術切除的標本。其中鱗癌62例，腺癌71例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例。Ⅰ期69例，

8、Ⅱ-Ⅲ期64例。20例新鮮肺癌組織和癌旁肺組織來自2010-2011年原發(fā)性肺癌患者外科手術切除標本。癌旁組織距離癌巢達5cm以上。一部分標本在切除后5分鐘內(nèi)取材并迅速置液氮中速凍，然后置于-80℃深凍冰箱保存?zhèn)溆?。另一部分標本離體后用中性福爾馬林固定。
　　2、支氣管上皮、肺鱗癌和肺腺癌細胞系
　　正常支氣管上皮細胞系HBE，腺癌細胞系A549、H1299購自美國標準菌種收藏所。肺鱗癌細胞系LK2、LH7和腺癌細胞系LTE

9、、SPC購自中國科學院上海細胞庫。
　　3、免疫組織化學染色
　　將石蠟組織切成4μm厚切片，脫蠟，脫水，在PH6檸檬酸鹽修復液中高溫高壓修復3分鐘，3％H2O2孵育20分鐘。抗RNF146多克隆抗體、抗Axin和抗β-catenin多克隆抗體4℃孵育過夜。采用EnVision試劑盒檢測抗體結(jié)合。以PBS代替一抗作為陰性對照。DAB顯色，蘇木素復染細胞核，封片。
　　4、質(zhì)粒構(gòu)建
　　pEX4-hRNF146和對

10、照pEX4質(zhì)粒，pGPHI-shhRNF146和對照質(zhì)?？蛰d體pGPHI shNC均由GenePharma公司構(gòu)建。si Axin、siβ-catenin和si TCF4購自SantaCruz公司。
　　5、細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染
　　肺癌細胞系用含10％熱滅活胎牛血清的RPMI1640或DMEM-F12、100U/ml的青霉素、100U/ml的鏈霉素的培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。每2-3天用0.25％胰酶消化傳代。

11、轉(zhuǎn)染前24小時將細胞按50％密度接種于24孔板，采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染試劑根據(jù)說明書將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肺癌細胞系A549和LTE中，Western blot檢測轉(zhuǎn)染效果。
　　6、 RT-PCR
　　將組織或轉(zhuǎn)染后的細胞收集，用Trizol Reagent提取轉(zhuǎn)染后細胞的總RNA，具體操作步驟按TaKaRa RNA Kit說明書進行，提取的基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計定量后，進行P

12、CR反應。
　　7、Western blot
　　將含60μg總蛋白的裂解產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5％正常血清封閉，一抗4℃孵育過夜，分別與對應的二抗室溫孵育2小時，ECL顯色，結(jié)果經(jīng)自動電泳凝膠成像分析儀采集，進行灰度值測定。
　　8、免疫熒光染色
　　固定后的細胞爬片用0.2％ Triton(Ⅹ)-100處理15分鐘，PBS沖洗，非免疫動物血清封閉30分鐘，滴加一抗，4℃孵育過夜。二

13、抗滴加FITC或TRITC標記山羊抗鼠/兔IgG，37℃孵育1小時， DAPI復染細胞核。同時設立陽性和陰性對照。熒光顯微鏡觀察熒光信號，采集圖像。采用IPP軟件進行光密度值分析。
　　9、MTT檢測細胞增殖
　　轉(zhuǎn)染12小時后，將各轉(zhuǎn)染組細胞及對照組細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl含104個細胞，培養(yǎng)24小時，使用MTT檢測試劑盒檢測細胞增殖情況，連續(xù)檢測4天。吸光度由microplate reader檢測，波

14、長490nm。單純加DMSO試劑的孔作為測量值的內(nèi)參對照，最終值為測量值減去內(nèi)參對照值。繪制細胞生長曲線。
　　10、細胞劃痕實驗
　　用marker筆在6孔板背后，大約每隔0.5-1cm均勻地劃橫線。每孔至少穿過5條線。在孔中加入約5×105個細胞，培養(yǎng)24h后用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕。用PBS洗細胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。按0，6，12，24小時取樣，拍照。實驗至少重復3次，

15、取平均值。
　　11、Transwell檢測細胞遷移和侵襲
　　取100μl細胞懸液（2.5×106個/ml）加入上室中，下室加入600μl含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液。上下室之間用孔徑為8μm的聚碳酸酯微孔濾膜分開，37℃、5％CO2孵育箱中培養(yǎng)6小時后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗，甲醇室溫固定15分鐘，用棉簽擦掉上表面的細胞，蘇木素染色，室溫干燥過夜，取下聚碳酸酯微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細胞侵襲能力的測定用預冷

16、的無血清RPMI1640培養(yǎng)基以1∶3稀釋Matrigel加入上室100μl，在室溫下放置3小時。培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。
　　12、細胞周期實驗
　　細胞轉(zhuǎn)染24小時后，用0.25％的胰酶消化，吹起后收集，在PBS中離心清洗2次，以70％冷乙醇固定。PBS洗2次去除乙醇，在細胞中加入0.1 mg/ml的RNaseA，37℃，30分鐘，然后加入50mg/L的碘化丙啶1ml染色30分鐘。用流式細胞儀進行DNA含量和細胞周期分析

17、。
　　13、統(tǒng)計學分析
　　應用x2和Fisher檢驗對RNF146、Axin、β-catenin在NSCLC和癌旁肺組織中mRNA及蛋白表達水平及其與臨床病理因素間的關系進行統(tǒng)計學處理。Kaplan-Meier顯示生存曲線，用Log-rank檢驗判斷差異性。t檢驗用于其它數(shù)據(jù)比較，計量資料以三次獨立實驗的(x)±s表示。使用Mann-Whitney test和Kruskal-Wallistest統(tǒng)計Western Blo

18、t、RT-PCR、MTT assay、Matrigelin vasive assay的結(jié)果，以mean±SD表示，以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、RNF146 mRNA和蛋白在NSCLC中過表達
　　我們用RT-PCR和Western-Blot方法檢測20例配對新鮮NSCLC和癌旁肺組織中RNF146的mRNA及蛋白表達情況，85％(17/20)的病例RNF146 mRNA的表達水平明顯高于癌旁肺

19、組織。只有3例顯示癌旁組織中RNF146mRNA的水平與癌組織相當或高于癌組織(P=0.030)。80％(16/20)的病例RNF146蛋白表達量明顯高于癌旁肺組織(P=0.014)。
　　免疫組化檢查顯示133例NSCLC中RNF146高表達為72例，低表達為61例。RNF146蛋白陽性表達信號主要位于腫瘤細胞的細胞質(zhì)中。鄰近腫瘤的支氣管粘膜上皮細胞呈弱或陰性表達。40例癌旁肺組織中僅有8例RNF146呈弱或中等強度表達，并且陽

20、性信號定位于正常支氣管粘膜上皮細胞中，在肺泡上皮細胞中呈陰性表達（P＜0.05）。
　　2、RNF146蛋白在NSCLC中的表達與臨床病理因素及Ⅰ期肺癌患者預后生存期有關
　　對133例NSCLC的RNF146表達與臨床病理因素相關性進行統(tǒng)計學分析顯示RNF146蛋白的表達與腫瘤大小(P=0.044)、組織學分型(P=0.005)、低分化(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.009)和pTNM分期(P=0.015)相關。與

21、患者年齡、性別無關(P＞0.05)。Kaplan-Meier分析RNF146與肺癌患者生存時間的關系發(fā)現(xiàn)，RNF146的過表達與Ⅰ期肺癌患者預后生存期有關(P=0.016)，RNF146過表達的Ⅰ期肺癌患者生存率明顯低于RNF146低表達的患者。與被統(tǒng)計的全部患者或Ⅱ、Ⅲ期NSCLC患者的生存時間無明顯相關性。
　　3、人正常支氣管上皮細胞系HBE及6種非小細胞肺癌細胞系中存在不同程度的RNF146mRNA和蛋白的表達
　　

22、RT-PCR和Western-Blot方法檢測了人正常支氣管上皮細胞系HBE及6種NSCLC細胞系中RNF146 mRNA和蛋白的表達情況。結(jié)果顯示HBE和LK2（鱗癌）中RNF146 mRNA和蛋白均顯示相對低的表達，LTE（腺癌）和LH7（鱗癌）中RNF146蛋白呈中等強度表達，而A549和H1299（均為腺癌）的蛋白水平表達較高。
　　4、NSCLC組織中RNF146蛋白表達與Axin表達呈負相關，與β-catenin的核表

23、達呈正相關
　　免疫組化方法檢測133例NSCLC中Axin和β-catenin的表達情況顯示，75/133例(56.4％) NSCLC Axin的胞質(zhì)表達減弱或缺失。72例RNF146高表達的病例中49例(68.1％) Axin表達減弱或缺失，RNF146低表達的61例中只有26例(42.6％) Axin表達減弱或缺失。RNF146與Axin的表達呈明顯的負相關(P=0.003)。
　　93/133例(69.9％) NSC

24、LC中β-catenin細胞膜表達減少或消失，出現(xiàn)胞質(zhì)的表達，其中26例(19.5％)出現(xiàn)細胞核的表達。統(tǒng)計學分析顯示，β-catenin細胞膜表達的減弱和細胞質(zhì)表達的增多與RNF146的表達無相關性(P=0.524)。但在72例RNF146高表達標本中19例(26.4％)出現(xiàn)β-catenin細胞核陽性表達，61例RNF146低表達標本中只有7例(11.5％)出現(xiàn)核陽性。RNF146的高表達與β-catenin的細胞核表達呈正相關(P

25、=-0.047)。
　　5、NSCLC中過表達或干擾RNF146影響Axin的表達和β-catenin核定位
　　分別在LTE細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染pEX4-hRNF146質(zhì)粒和對照pEX4空質(zhì)粒，上調(diào)RNF146的表達;在A549細胞系中瞬時轉(zhuǎn)染RNF146 shRNA和對照shNC，干擾RNF146的表達。轉(zhuǎn)染48小時后，Western-Blot檢測RNF146的轉(zhuǎn)染效率以及Axin和β-catenin的變化。結(jié)果顯示，LTE

26、肺癌細胞中RNF146的上調(diào)能夠抑制Axin蛋白的表達，并增加β-catenin的蛋白水平。反之，A549細胞中干擾RNF146能增加Axin蛋白水平，減少β-catenin蛋白水平。RT-PCR檢測Axin和β-catenin的mRNA水平時沒有發(fā)現(xiàn)這種改變。
　　免疫熒光染色檢測轉(zhuǎn)染后Axin和β-catenin在細胞內(nèi)的表達及定位。結(jié)果進一步顯示過表達RNF146的LTE細胞中，Axin胞質(zhì)表達減少，β-catenin胞質(zhì)和

27、胞核中的表達均增多。相反，干擾RNF146的A549細胞中，Axin胞質(zhì)表達明顯增多，β-catenin胞質(zhì)和胞核中的表達均減少。
　　6、RNF146調(diào)節(jié)cyclinD1和cyclinE水平，調(diào)控細胞周期并促進肺癌細胞增殖
　　LTE和A549細胞系分別轉(zhuǎn)染pEX4-RNF146和RNF146-shRNA以及各對照質(zhì)粒，MTT觀察各組肺癌細胞增殖情況。LTE細胞系轉(zhuǎn)染pEX4-RNF146組細胞增殖明顯，而空質(zhì)粒組和對照組

28、細胞增殖相對較慢。shRNF146干擾A549細胞系后，肺癌細胞的增殖明顯較對照組慢。流式細胞儀檢測各組細胞周期變化情況顯示，LTE細胞系中與對照組和空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染組的G0/G1期比例明顯減少，S期比例增加。干擾RNF146的A549細胞系G0/G1期比例增加，S期比例減少。
　　我們用Western-Blot檢測了與細胞周期相關的調(diào)控蛋白的表達情況。上調(diào)RNF146可以使肺癌細胞cyclin D1，cyclin E and

29、CDK4表達明顯增多，而對cyclinA、cyclinB、pRB、P21、P27和P53無明顯影響。干擾RNF146后，cyclinD1，cyclinE和CDK4表達減少。
　　7、RNF146促進肺癌細胞遷移和侵襲，調(diào)節(jié)MMP2和MMP7的變化
　　過表達和干擾RNF146后，我們采用Wound-healing實驗和Transwell實驗檢測了LTE和A549肺癌細胞遷移和侵襲能力的變化。Wound-healing結(jié)果顯示

30、24小時LTE轉(zhuǎn)染組劃痕明顯縮小且有融合趨勢。A549干擾組細胞遷移較對照組和空質(zhì)粒組緩慢。Transwell實驗檢測肺癌細胞的遷移侵襲率:LTE轉(zhuǎn)染組遷移和侵襲實驗都可見到Transwell小室下表面的LTE細胞穿出率較對照組和空質(zhì)粒組增多。A549細胞系轉(zhuǎn)染shRNF146，與未處理對照組和空質(zhì)粒組比較，Transwell小室下表面的A549細胞穿出率減少。
　　Western-Blot方法檢測了過表達或干擾RNF146后MM

31、P2、MMP7、RhoA、RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表達變化。結(jié)果過表達RNF146后LTE細胞內(nèi)MMP2和MMP7表達明顯增加，而RhoB、RhoC、Rock1、TIMP-1等蛋白的表達變化不明顯。而干擾RNF146后A549中MMP2和MMP7表達明顯減少。
　　8、肺癌RNF146通過Wnt/β-catenin途徑調(diào)節(jié)靶蛋白cyclinD1和MMP7的水平
　　在A549細胞系中干擾RNF14

32、6和Axin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，在干擾了Axin的細胞中RNF146的下調(diào)并不能使β-catenin、cyclinD1、cyclinE和MMP7的水平明顯減少。在過表達RNF146的LTE細胞中，敲除β-catenin，與對照組比較，盡管Axin水平明顯減少，但也不能明顯增加cyclinD1、cyclinE和MMP7的水平。而對MMP2的影響依然存在。這進一步證明RNF146是通過影響Axin和β-catenin，從而調(diào)節(jié)肺癌細胞增

33、殖和侵襲相關蛋白。
　　9、肺癌細胞中RNF146對cyclinD1和MMP7的調(diào)控依賴TCF-4
　　我們在分別過表達或干擾RNF146的LTE和A549細胞中干擾TCF-4的表達水平，然后觀察cyclinD1和MMP7的蛋白表達水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾了內(nèi)源性TCF-4的細胞系，RNF146的上調(diào)并不能使cyclinD1和MMP7的表達增多。而在RNF146和TCF-4同時敲除的A549中，cyclinD1和MMP7的表

34、達明顯減少。這些說明了RNF146對cyclinD1和MMP7的調(diào)控作用是依賴于TCF-4而存在的。
　　結(jié)論：
　　1、RNF146 mRNA和蛋白在NSCLC和細胞系中過表達，并與肺癌大小、不良分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和p-TNM分期等臨床病理因素相關;RNF146的過表達與Ⅰ期非小細胞肺癌患者預后生存期有關。
　　2、NSCLC組織中RNF146蛋白表達與Axin表達呈負相關，與β-catenin的核表達呈正相關。肺癌細