組培三大難題

1、（吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林 長春 130118）摘要：植物組織培養(yǎng)是以細胞全能性為理論基礎建立的一種離體培養(yǎng)技術，闡述了植物組織培養(yǎng)快繁中褐變、玻璃化、污染和移栽成活率低等問題出現(xiàn)的原因，提出預防和控制措施。 關鍵詞：植物組織培養(yǎng)；污染；玻璃化；褐化中圖分類號：Q813.1+2基金項目：1. 吉林省自然科學基金項目（201215178） 2.吉林省博士后科研項目啟動經(jīng)費資助[吉人社辦字（2009）第 100 號]植物組織培養(yǎng)是利用

2、植物體的一部分進行無性繁殖，而產(chǎn)生大量同源母本基因幼苗的生物技術。植物的組織培養(yǎng)到如今以和農(nóng)業(yè)、園藝、林業(yè)、醫(yī)藥等多個方面有了密不可分的關系，為其提供了理論基礎和研究方法。利用自然條件在獲得珍稀植物和經(jīng)濟價值較高的植物時，由于受地域及季節(jié)的限制，很難達到高效、快速的目的。通過組織培養(yǎng)這一技術手段則能滿足這一要求。組織培養(yǎng)在挽救珍惜植物、創(chuàng)造新物種等方面做出了重要的貢獻[1]。 但是在植物的組培技術上面臨的三個難題卻經(jīng)常困擾大家。它們分別

3、是污染，植物玻璃化和植物褐化。 1 污染 污染是在組培過程中所面臨的首要難題，該問題經(jīng)常遇到并且難以解決。不能把污染率降低到可行的范圍內(nèi)植物組培就很難進行下去，這是該問題所要面對的第一個難題。 在進行植物的組織培養(yǎng)時,通常存在兩種污染方式：一種是外植體消毒不徹底以及無菌操作過程中引起的污染；另一種是引起內(nèi)源菌污染的主要原因的真菌和細菌 [2]。大多數(shù)的研究結果表明引起污染的主要原因為外植體的生長狀況、環(huán) 境條件和操作過程[3]。 外植

4、體污染是最難解決的污染之一。污染來源主要為外植體處理不當或培養(yǎng)基的滅菌不徹底，或?qū)臃N工具的消毒不夠，或操作人員的操作不慎，或環(huán)境不潔等所致。 選取外植體的原則是污染少易啟動 [4-5]。選擇有最大分化潛能的外植體是確保組織培養(yǎng)成功的關鍵[6]。常規(guī)試驗一般選用 0.1%HgCl2 溶液浸泡，再用無菌水對外植體進行反復沖洗，滅菌效果最好且污染率低。胡重怡等在煙草無菌苗培養(yǎng)前種子消毒技術的研究中使用先用 70%C2H5OH 溶液進行消毒，

5、再用 30%H2O2 的浸泡，再用無菌水反復沖洗外植體，所得煙草種子污染率底[7]，H2O2 分解后生成有殺菌作用的氧氣而成為無毒害的化合物[8-9]2.5 植物激素 在內(nèi)源激素方面當外植體發(fā)生玻璃化時，外植體內(nèi)源激素也在發(fā)生著顯著的變化。乙烯（ETH）是否對植物組織玻璃化起作用學術界對此意見不一， Kevers 和 Gaspar 報道在對石竹進行誘導玻璃化時產(chǎn)生大量 ETH,，導致玻璃苗中 ETH 含量高于正常組織，但誘發(fā)組培苗玻璃化

6、的原因卻不是 ETH 的大量產(chǎn)生，這是因為誘導玻璃苗的產(chǎn)生與是否添加 ETH 前體ACC 和是否提高培養(yǎng)容器中 ETH 水平無關[17]。此外，蘋果的玻璃苗葉片和莖尖中細胞分裂素（CTK）含量顯著上升，但是在莖葉極度玻璃化時， CTK 含量就會明顯的下降[18]。對赤霉素的敏感性石竹的玻璃苗要遠高于高于正常苗[19]。從外源激素方面上來說，認為BA+NAA 比 KT+IBA 更易使玻璃苗產(chǎn)生，且隨著激素濃度的不斷升高，外植體的玻璃化率也

7、隨之升高。這可能是由于 NAA 誘導了外植體細胞分裂素的馴化，因而導致了內(nèi)源細胞分裂素較高而使玻璃苗產(chǎn)生。 2.6 糖的種類和濃度 李云等在對珠美海棠進行離體培養(yǎng)時用葡萄糖（C6H12O6）來替換相同濃度的蔗糖（C12H22O11）玻璃苗發(fā)生率明顯增加。認為 MS 培養(yǎng)基的糖濃度與玻璃苗發(fā)生率呈現(xiàn)極顯著負相關。 3 褐化 褐化是植物組織培養(yǎng)中一種常見的不利現(xiàn)象。褐化是指在對植物組織培養(yǎng)過程中在對外植體進行脫分化、再分化誘導時，通過外植體

8、表面的自身組織向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，使培養(yǎng)基顏色逐漸加深最終變成褐色，外植體逐漸變褐直至死亡的現(xiàn)象[20]。 目前大部分學者認為酶促反應是褐化的主要原因。褐化的發(fā)生是因為激活了組織中的多酚氧化酶，從而導致了酚類化合物被氧化成了醌類物質(zhì)。在酪氨酸酶的作用下的醌類物質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生了聚合，引起外植體其他酶系統(tǒng)的失活，導致代謝紊亂，使植物的生長受到阻礙[21]。 王穎，劉仁祥等在煙草愈傷組織培養(yǎng)褐化研究中加入抗褐化劑檸檬酸和 PVP，PVP

9、濃度是2g/L；檸檬酸濃度是 8mg/L 時較好地解決了煙草愈傷組織繼代培養(yǎng)中的褐化問題[22]。 姚永宏[23]等人在福鼎大白茶經(jīng)升汞消毒后使用磁力攪拌充分清洗材料對外植體褐化有較大的效果。為使外植體可以正常發(fā)育在培養(yǎng)基中加入活性炭也可適當改變激素的比例，同時還可防止褐變[24-25]。 4 展望 20 世紀 50 年代在證實了植物細胞“全能性“存在的基礎上，興起的一門植物細胞工程技術。一門以植物生理學為基礎發(fā)展起來的植物繁殖技術。經(jīng)