基因分型技術(shù)對(duì)益生菌嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌鑒定的研究.pdf

1、雙歧桿菌是人體或動(dòng)物消化道中最重要的一種生理性益生菌，于1899年由法國巴斯德研究所學(xué)者Tissier從母乳喂養(yǎng)兒的糞便中分離發(fā)現(xiàn)，隨著對(duì)雙歧桿菌的深入研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌能產(chǎn)生特殊物質(zhì)，抑制致病細(xì)菌的入侵，進(jìn)而起到調(diào)節(jié)身體免疫能力的作用，此外雙歧桿菌還在維持體內(nèi)微生態(tài)平衡、營養(yǎng)、協(xié)同降解多糖等多方面具有重要的生理功能，因此該菌種逐漸被應(yīng)用于各種嬰幼兒食品、藥品、保健品中。
　　國家為了益生菌乳制品的安全監(jiān)管，嚴(yán)格規(guī)范乳制品中菌株的

2、使用，頒布了《關(guān)于公布可用于嬰幼兒食品的菌種名單的公告》（衛(wèi)生部公告2011年第25號(hào)），與《GB10765-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》等制度，規(guī)定了可用于嬰幼兒乳制品等產(chǎn)品中的菌種類型和數(shù)量，此外國家標(biāo)準(zhǔn)《GB4789.34-2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢測(cè)雙歧桿菌的鑒定》中明確規(guī)定了食品中雙歧桿菌的常規(guī)檢測(cè)方法，該常規(guī)檢測(cè)方法主要針對(duì)菌種的數(shù)量或常見菌種的生理生化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，部分方法種屬特異性不高、重復(fù)性較差，并且

3、僅通過生理生化檢測(cè)，不能將菌種鑒定到菌株水平，不能達(dá)到衛(wèi)生部公布中規(guī)定的特定菌株的監(jiān)管要求。
　　分子分型技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種新型生物學(xué)技術(shù)，主要依據(jù)菌種的基因序列進(jìn)行菌種之間的鑒定分型，包含脈沖場(chǎng)凝膠電泳方法(PFGE)、限制性片段長度多態(tài)性分析法（RFLP）以及以PCR為基礎(chǔ)的多重PCR法、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)法(PCR-RFLP)、16S rRNA測(cè)序技術(shù)、多位點(diǎn)基因分型技術(shù)(MLST)等，其中16S rRNA基因

4、序列是菌種進(jìn)化的“活化石”，基于16S rRNA基因序列的分型技術(shù)是國際上公認(rèn)的較為廣泛的菌種鑒定方法;16S-23S rRNA基因區(qū)間是位于16S rRNA基因與23S rRNA基因之間的區(qū)間序列，相對(duì)于16S rRNA基因的高保守性，該基因區(qū)間具有更多的可變區(qū)，可用來分辨序列非常接近的菌種和種內(nèi)菌株;多位點(diǎn)序列分型技術(shù)(MLST)是Maiden等學(xué)者通過改良多位點(diǎn)酶電泳所形成的一種新型分子分型方法，該技術(shù)以菌種的7個(gè)管家基因?yàn)橐罁?jù)進(jìn)

5、行分型，既具有一定的保守性，又具有一定的可變性，能夠更準(zhǔn)確的表現(xiàn)菌種之間的親緣關(guān)系。
　　本文主要利用基于16S rRNA基因序列、基于16S-23S rRNA基因序列和基于MLST的基因分型技術(shù)，結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化分析，對(duì)12株雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和從20個(gè)益生菌乳粉樣品中分離得到的30個(gè)樣品菌株進(jìn)行研究，建立基因分型技術(shù)對(duì)益生菌嬰幼兒配方乳粉中雙歧桿菌鑒定的三種分析分型方法，主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)通過調(diào)研和品牌官方網(wǎng)站訪

6、問等方式發(fā)現(xiàn)國內(nèi)生產(chǎn)益生菌嬰幼兒乳粉的品牌占國內(nèi)乳粉品牌的36.4％，而在益生菌嬰幼兒乳粉中，75％為添加益生菌的嬰幼兒牛乳粉，25％為益生菌嬰幼兒羊乳粉;在對(duì)購買的乳粉樣品標(biāo)簽整理中發(fā)現(xiàn)，部分乳粉標(biāo)簽對(duì)菌株的相關(guān)信息或菌種含量的標(biāo)注較為規(guī)范，國內(nèi)品牌的標(biāo)簽合格率在83％以上，進(jìn)口品牌的標(biāo)簽合格率不足50％。
　　(2)通過對(duì)購買樣品的活菌數(shù)量檢測(cè)，得知20個(gè)樣品中16個(gè)樣品中活性益生菌的數(shù)量達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)，合格率為90％。標(biāo)簽標(biāo)示

7、中菌株信息和活菌數(shù)量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)的樣品數(shù)量為13，占所有樣品的65％。
　　(3)通過對(duì)12株標(biāo)準(zhǔn)雙歧桿菌和30株樣品菌株16S rRNA引物進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，利用系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，該技術(shù)能將雙歧桿菌的不同菌種進(jìn)行區(qū)分，16S rRNA發(fā)育樹中大多數(shù)分支的bootstrap值大于80，具有較好的分辨性;在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株中動(dòng)物雙歧桿菌的亞種進(jìn)行分型鑒定中，只能區(qū)分動(dòng)物雙歧桿菌動(dòng)物亞種與其他動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種，而乳亞種之間不能夠區(qū)分，原因主要

8、與菌種16S rRNA基因的高度保守性有關(guān)聯(lián);在對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí)，能夠較為準(zhǔn)確的對(duì)樣品菌株進(jìn)行區(qū)分。
　　(4)利用16S-23S rRNA分型技術(shù)結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析對(duì)12株標(biāo)準(zhǔn)雙歧桿菌和30株樣品菌株進(jìn)行鑒定分型，其分型鑒定結(jié)果與16S rRNA分型技術(shù)相似，能夠準(zhǔn)確的將雙歧桿菌區(qū)分到亞種水平，且區(qū)分度達(dá)到90以上;在對(duì)樣品分離菌株進(jìn)行鑒定中，該技術(shù)的分辨率達(dá)到85以上，相對(duì)于基于16S rRNA的分型技術(shù)具有較高的分辨性。