釀酒酵母耐受抑制劑的性能強化.pdf

1、木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中產(chǎn)生的毒性化合物是限制纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的主要瓶頸之一。種類繁多的抑制劑對細胞產(chǎn)協(xié)同抑制從而影響后續(xù)的發(fā)酵效率，因此強化細胞的抑制劑耐受能力對解決抑制劑的毒性問題尤為關(guān)鍵。
　　本研究首先從代謝水平上系統(tǒng)解析釀酒酵母對三種典型抑制劑混合物（糠醛、乙酸和苯酚）的適應(yīng)過程，結(jié)合單基因敲除策略，證實了能量代謝、丙氨酸代謝、谷氨酸合成代謝、氧化還原調(diào)控系統(tǒng)--甘油合成代謝和谷氨酸分解代謝、脯氨酸合成代謝以及肌醇合成

2、代謝在維持細胞復(fù)合抑制劑耐受能力中的重要作用。進而發(fā)現(xiàn)外源添加一定濃度的脯氨酸和肌醇能夠提高菌株在復(fù)合抑制劑中的生長能力。而過表達合成路徑的關(guān)鍵基因PRO1或INO1增強脯氨酸或肌醇的胞內(nèi)合成使得菌株復(fù)合抑制劑條件下的發(fā)酵速率提高了2倍左右?？紤]到脯氨酸對關(guān)鍵基因PRO1的反饋抑制問題，結(jié)合定點突變和隨機突變策略，構(gòu)建得到的突變菌株BY4742/PRO1D154N,G220C在復(fù)合抑制劑中的發(fā)酵時間由125 h縮短至30 h。對不同PR

3、O1突變株胞內(nèi)的脯氨酸含量測定表明適量的脯氨酸水平對發(fā)揮其壓力保護作用至關(guān)重要。而胞內(nèi)活性氧的變化暗示了脯氨酸作為活性氧清除劑保護細胞抵抗抑制劑脅迫的功能。
　　基于細胞耐受機制，特異性地選擇外源模塊調(diào)控細胞對抑制劑的耐受能力。通過在釀酒酵母中異源表達γ-氨基丁酸反向轉(zhuǎn)運蛋白GadC，并通過啟動子策略優(yōu)化其在細胞內(nèi)的表達水平，發(fā)現(xiàn)低表達水平的GadC模塊使得乙酸環(huán)境下菌株的發(fā)酵速率提高3倍左右，代謝水平分析發(fā)現(xiàn)GadC模塊的表達降

4、低了細胞對抗氧化劑的需求，增強了胞內(nèi)的能量供應(yīng)；基于全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控策略，構(gòu)建外源全局調(diào)控因子IrrE的突變庫，定向篩選得到了耐受性明顯增強的突變酵母菌株，在復(fù)合抑制劑條件下的發(fā)酵速率提高了4倍，同時其對溫度的耐受能力也得到明顯提升，而突變位點分析證實了IrrE蛋白中I103T、E119V、S133R、L160F、P162S、R244G、V299A和A300V的突變在強化酵母細胞抑制劑耐受性中的關(guān)鍵作用。
　　另外本研究解析了五六碳糖