釀酒酵母耐受抑制劑的性能強(qiáng)化.pdf

1、木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程中產(chǎn)生的毒性化合物是限制纖維素乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的主要瓶頸之一。種類繁多的抑制劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)協(xié)同抑制從而影響后續(xù)的發(fā)酵效率，因此強(qiáng)化細(xì)胞的抑制劑耐受能力對(duì)解決抑制劑的毒性問(wèn)題尤為關(guān)鍵。
　　本研究首先從代謝水平上系統(tǒng)解析釀酒酵母對(duì)三種典型抑制劑混合物（糠醛、乙酸和苯酚）的適應(yīng)過(guò)程，結(jié)合單基因敲除策略，證實(shí)了能量代謝、丙氨酸代謝、谷氨酸合成代謝、氧化還原調(diào)控系統(tǒng)--甘油合成代謝和谷氨酸分解代謝、脯氨酸合成代謝以及肌醇合成

2、代謝在維持細(xì)胞復(fù)合抑制劑耐受能力中的重要作用。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)外源添加一定濃度的脯氨酸和肌醇能夠提高菌株在復(fù)合抑制劑中的生長(zhǎng)能力。而過(guò)表達(dá)合成路徑的關(guān)鍵基因PRO1或INO1增強(qiáng)脯氨酸或肌醇的胞內(nèi)合成使得菌株復(fù)合抑制劑條件下的發(fā)酵速率提高了2倍左右?？紤]到脯氨酸對(duì)關(guān)鍵基因PRO1的反饋抑制問(wèn)題，結(jié)合定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變策略，構(gòu)建得到的突變菌株BY4742/PRO1D154N,G220C在復(fù)合抑制劑中的發(fā)酵時(shí)間由125 h縮短至30 h。對(duì)不同PR

3、O1突變株胞內(nèi)的脯氨酸含量測(cè)定表明適量的脯氨酸水平對(duì)發(fā)揮其壓力保護(hù)作用至關(guān)重要。而胞內(nèi)活性氧的變化暗示了脯氨酸作為活性氧清除劑保護(hù)細(xì)胞抵抗抑制劑脅迫的功能。
　　基于細(xì)胞耐受機(jī)制，特異性地選擇外源模塊調(diào)控細(xì)胞對(duì)抑制劑的耐受能力。通過(guò)在釀酒酵母中異源表達(dá)γ-氨基丁酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC，并通過(guò)啟動(dòng)子策略優(yōu)化其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)低表達(dá)水平的GadC模塊使得乙酸環(huán)境下菌株的發(fā)酵速率提高3倍左右，代謝水平分析發(fā)現(xiàn)GadC模塊的表達(dá)降

4、低了細(xì)胞對(duì)抗氧化劑的需求，增強(qiáng)了胞內(nèi)的能量供應(yīng)；基于全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控策略，構(gòu)建外源全局調(diào)控因子IrrE的突變庫(kù)，定向篩選得到了耐受性明顯增強(qiáng)的突變酵母菌株，在復(fù)合抑制劑條件下的發(fā)酵速率提高了4倍，同時(shí)其對(duì)溫度的耐受能力也得到明顯提升，而突變位點(diǎn)分析證實(shí)了IrrE蛋白中I103T、E119V、S133R、L160F、P162S、R244G、V299A和A300V的突變?cè)趶?qiáng)化酵母細(xì)胞抑制劑耐受性中的關(guān)鍵作用。
　　另外本研究解析了五六碳糖