不產(chǎn)氧光合細(xì)菌砷代謝基因表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、目前，微生物單一砷代謝機(jī)制研究較為深入，但在一些微生物的砷代謝基因簇中，同時(shí)含有多個(gè)砷操縱子，例如，同時(shí)含有細(xì)胞質(zhì) As(V)還原和呼吸性As(V)還原操縱子（Shewanella sp. strain ANA-3），As(III)氧化與呼吸性As(V)還原操縱子（Herminiimonas arsenicoxydans）等。然而，對(duì)于同一微生物，不同砷操縱子中砷代謝基因之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系、以及如何協(xié)調(diào)對(duì)砷進(jìn)行轉(zhuǎn)化或代謝的分子機(jī)制研究甚

2、少。這種同一微生物不同砷代謝機(jī)制之間的調(diào)控關(guān)系是目前微生物砷代謝機(jī)制研究的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題，闡明多操縱子基因的表達(dá)調(diào)控以及對(duì)環(huán)境砷的響應(yīng)關(guān)系，對(duì)于深入理解微生物在砷的地球化學(xué)循環(huán)的重要作用、以及砷污染環(huán)境的微生物修復(fù)都具有重要意義。
　　不產(chǎn)氧光合細(xì)菌(Anoxygenic phototrophic bacteria，APB) Rhodopseudomonas palustris CGA009基因背景清楚，擁有細(xì)胞質(zhì)As(V)還

3、原和As(III)甲基化的相關(guān)基因，其分布在3個(gè)砷操縱子上，有4個(gè)調(diào)控蛋白基因（arsR），可以作為研究多砷操縱子基因之間砷代謝基因表達(dá)調(diào)控的良好模型。本文以CGA009菌株為研究對(duì)象，首次從轉(zhuǎn)錄水平上探究了多個(gè)砷操縱子基因在不同砷環(huán)境條件下表達(dá)情況，闡明了砷與CGA009菌株3個(gè)操縱子基因的表達(dá)關(guān)系。在此基礎(chǔ)上，克隆表達(dá)并獲得了該菌株中的4個(gè)砷代謝調(diào)控蛋白（ArsR），并探究了ArsR與其中1個(gè)ars operon操縱區(qū)相互作用，以揭

4、示CGA009菌株的3個(gè)ars operon在不同條件下表達(dá)調(diào)控的原因。還獲得1株對(duì)砷具有高吸附特性的砷代謝調(diào)控蛋白重組菌株，研究了其對(duì)砷的吸附特性。主要結(jié)果如下：
　　采用分光光度法和real-time PCR方法，研究了砷對(duì)該菌株生長(zhǎng)影響以及3個(gè) ars operon基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：光照厭氧條件下，As(V)和As(III)對(duì)CGA009菌株生長(zhǎng)抑制的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）分別為2.44 mmol/L和1.55 m

5、mol/L，表明該菌株對(duì)砷具有良好的抗性。在As(III)和As(V)誘導(dǎo)下，ars2和ars3 operon基因能表達(dá)，但ars1 operon基因不表達(dá)。隨著As(III)濃度的升高，ars2和ars3 operon基因表達(dá)量也隨之升高。在低濃度（<1×10-6 mol/L）As(III)時(shí)即可誘導(dǎo)ars2 operon表達(dá)，繼續(xù)升高As(III)濃度，能誘導(dǎo)ars2和ars3 operon同時(shí)表達(dá)，但ars2 ope ron的表達(dá)

6、量更高，當(dāng)升高至1×10-3 mol/L As(III)時(shí)，二者表達(dá)量無(wú)明顯差別。As(V)存在時(shí)，ars2 operon和ars3 operon均在對(duì)數(shù)前期表達(dá)量最高，隨著細(xì)菌生長(zhǎng)，生物量升高，這2個(gè)operon砷代謝基因的表達(dá)量逐漸降低。因此，從轉(zhuǎn)錄水平可知，環(huán)境中As(III)濃度較低時(shí)，該菌株可通過(guò)細(xì)胞質(zhì) As(V)還原和As(III)外排的機(jī)制代謝砷，高濃度 As(III)時(shí)，除了 As(V)還原和As(III)外排外，還應(yīng)同

7、時(shí)具有As(III)甲基化作用。
　　構(gòu)建CGA009菌株4個(gè)arsR基因表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)表達(dá)，Ni-NTA純化，得到這4個(gè) ArsR蛋白。通過(guò)凝膠滯緩試驗(yàn)（EMSA）檢測(cè)這4個(gè)ArsR蛋白與ars1和ars2 operon的操縱區(qū)序列pars1和pars2的相互作用關(guān)系，結(jié)果顯示4個(gè)蛋白都能分別與pars1和pars2作用，說(shuō)明CGA009菌株的4個(gè)ArsR蛋白能參與調(diào)控ars1和a

8、rs2 operon的表達(dá)。50 mmol/L As(III)能夠使這4個(gè)ArsR蛋白與pars1的復(fù)合物解離，表明ars1 operon的表達(dá)可能受高濃度As(III)誘導(dǎo)，但有待進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　4個(gè)arsR基因的重組E.coli菌株對(duì)3.0 mmol/L As(III)的抗性能力測(cè)定，其中 E.coli(ArsR2)的抗性最高。采用原子熒光光譜法探究 E.coli(ArsR2)對(duì)砷吸附特征，結(jié)果顯示：與對(duì)照菌株相比，E.co

9、li(ArsR2)對(duì)As(III)和As(V)的吸附能力分別提高了3.8倍和2.6倍，說(shuō)明E.coli(ArsR2)對(duì)As(III)和As(V)具有較好吸附作用。該重組菌株對(duì)As(III)和As(V)的吸附的熱力學(xué)過(guò)程均符合Langmuir模型。約50 min時(shí)E.coli(ArsR2)對(duì)As(III)吸附達(dá)到吸附平衡，吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程符合偽一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。pH7時(shí)，E.coli(ArsR2)對(duì)As(III)吸附量最大，pH8時(shí)對(duì)As(V