細(xì)菌砷解毒基因的鑒定及功能研究.pdf

1、砷是一種劇毒類金屬，在自然環(huán)境中主要以亞砷酸鹽（As（Ⅲ））和砷酸鹽（As（Ⅴ））的無(wú)機(jī)形式存在并通過(guò)微生物的氧化和還原相互轉(zhuǎn)化。As（Ⅲ）不帶電荷且移動(dòng)性強(qiáng)，其毒性和危害性比As（Ⅴ）大很多，因而，微生物可以通過(guò)對(duì)砷的氧化還原轉(zhuǎn)化危害人類的健康和安全。本論文圍繞砷抗性細(xì)菌對(duì)As（Ⅲ）的氧化和細(xì)胞質(zhì)As（Ⅴ）的還原開展了以下兩方面的研究工作，主要結(jié)果如下：
　　 在我國(guó)砷高污染TS區(qū)、中污染SY區(qū)、低污染LY區(qū)和YC區(qū)分別采集了

2、4個(gè)土壤樣品，從這4個(gè)代表3種不同砷污染水平土壤樣品中共分離到58株砷抗性菌（TS1-45、SY1-8、LY1-4和YC1），其中共有12株As（Ⅲ）高抗菌株（MICs>20 mM），并且都是從高污染TS區(qū)中分離得到，分布在Acinetobacter、Agrobacterium、Arthrobacter、Comamonas、Rhodococcus、Stenotrophomonas和Pseudomonas等7個(gè)屬。利用KMnO4法從58株

3、菌中檢測(cè)出5株As（Ⅲ）氧化菌（Achromobacter sp．SY8、Pseudomonas sp．TS44和Agrobacterium spp．TS43．TS45，LY4），它們的平均As（Ⅲ）抗性水平高于其余53株非As（Ⅲ）氧化菌。采用簡(jiǎn)并PCR方法成功擴(kuò)增出5個(gè)編碼As（Ⅲ）氧化酶大亞基aoxB片段和51個(gè)As（Ⅲ）通道蛋白基因片段（18個(gè)arsB、12個(gè)ACR3（1）和21個(gè)ACR3（2）），發(fā)現(xiàn)aoxB特異性存在于As（

4、Ⅲ）氧化菌中，而arsB、ACR3（1）和ACR3（2）在As（Ⅲ）氧化菌和非As（Ⅲ）氧化菌中都存在。采用鄰近距離法構(gòu)建了58株菌16S rRNA基因進(jìn)化樹、5個(gè)aoxB和51個(gè)As（Ⅲ）通道蛋白基因的蛋白進(jìn)化樹，詳細(xì)分析并比較了它們之間的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)5個(gè)aoxB與其16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)生完全吻合，但有8個(gè)ACR3（2）和1個(gè)arsB與其16S rRNA基因的進(jìn)化矛盾，很可能是水平基因轉(zhuǎn)移所致。研究還發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期受砷污染的環(huán)境中

5、砷抗性菌的多樣性豐富而且As（Ⅲ）抗性水平高，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)水平基因轉(zhuǎn)移加快了砷抗性菌的側(cè)向進(jìn)化。本研究是對(duì)我國(guó)不同砷污染土壤中砷抗性菌及其抗性基因比較研究的首次報(bào)道，也是檢測(cè)As（Ⅲ）通道蛋白基因發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的首次報(bào)道。
　　 以上述其中兩株As（Ⅲ）氧化菌新種Achromobacter sp．SY8和Pseudomonas sp．TS44為研究對(duì)象，利用Fosmid文庫(kù)方法從SY8菌株中分離到一個(gè)17.5 kb的DNA序列，

6、覆蓋了完整的As（Ⅲ）氧化酶基因簇（aoxX-aoxS-aoxR和aoxA-aoxB-aoxC-aoxD），利用反向PCR方法從TS44菌株中克隆到一個(gè)14.6 kb的DNA序列，包含了完整的As（Ⅲ）氧化酶基因簇（arsD-arsA-aoxA-aoxB）和砷抗性基因簇（arsC1-arsR-arsC2-ACR3-arsH-DSP-GAPDH-MFS）。通過(guò)RT-PCR研究發(fā)現(xiàn)：SY8的aoxXSR和aoxABCD分別共轉(zhuǎn)錄，屬于兩個(gè)操

7、縱子；TS44的兩個(gè)基因簇各自共轉(zhuǎn)錄，每個(gè)基因簇屬于一個(gè)操縱子；除了TS44的arsC1-arsR組成型表達(dá)外，上述所有基因在加入As（Ⅲ）、As（Ⅴ）或Sb（Ⅲ）誘導(dǎo)后表達(dá)水平均上調(diào)。生物信息學(xué)分析表明SY8 As（Ⅲ）氧化酶基因簇受雙組分信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控，但是與已報(bào)道的Agrobacterium tumefaciens5A具有較大的差異性，因此推測(cè)在SY8中存在一套新型細(xì)菌As（Ⅲ）感應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)的雙組分調(diào)控模型。TS44的As（Ⅲ

8、）氧化酶基因簇結(jié)構(gòu)不典型，因?yàn)樗缓薪Y(jié)構(gòu)基因并在其上游出現(xiàn)了arsDA，但是除了TS44外，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有檢索到其它只含有結(jié)構(gòu)基因的As（Ⅲ）氧化酶基因簇。TS44的砷抗性基因簇的前5個(gè)基因被廣泛報(bào)道與砷抗性相關(guān)，但是后3個(gè)基因則沒有被報(bào)道與砷抗性有關(guān)。上述三點(diǎn)分別揭示了SY8和TS44的3個(gè)砷解毒基因簇結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和新穎性。
　　 本論文的結(jié)果在抗砷性微生物資源的開發(fā)、砷污染環(huán)境的微生物生態(tài)、細(xì)菌砷代謝和細(xì)菌砷