脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選、酶基因克隆及應(yīng)用研究.pdf

1、脂肪酶是一種酯鍵水解酶，它們能夠進(jìn)行非水相催化的特性使其能夠用于生產(chǎn)許多高附加值的、用化學(xué)方法難以合成的水不溶性產(chǎn)品，目前在非水介質(zhì)中的脂肪酶催化反應(yīng)已經(jīng)被成功應(yīng)用在多肽合成、聚合物合成、藥物合成、立體異構(gòu)體拆分、精細(xì)化工、食品和香料生產(chǎn)及油脂改性等，成為當(dāng)前生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。 本論文主要從脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化、誘變育種、脂肪酶基因的克隆、脂肪酶在有機(jī)相中的催化等幾方面進(jìn)行了研究。 本論文首先經(jīng)過(guò)富

2、集、平板初篩及搖瓶復(fù)篩試驗(yàn)，篩選到具脂肪酶活的菌株80余株，其中C3酶活較高。C3和G5固定化脂肪酶能夠高效催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)生產(chǎn)生物柴油。通過(guò)對(duì)C3和G5進(jìn)行18S rDNA分析，結(jié)合形態(tài)觀察，初步確定此兩株菌都屬于地霉菌屬(Geotrichum)。對(duì)C3胞外粗酶液酶基本性質(zhì)的研究表明：C3脂肪酶胞外粗酶液作用的最適溫度為40℃，最適作用pH為7.5，在50℃以?xún)?nèi)和pH6.0～8.0之間有較好的穩(wěn)定性。隨后，對(duì)篩選到的C3菌株液體搖瓶產(chǎn)脂肪

3、酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定其最適產(chǎn)酶條件為：黃豆粉1.5g蛋白胨1.0g硫酸銨0.5g蔗糖1.5g KH2PO4 0.1g MgSO4·7H2O 0.05g橄欖油1mL H2O 100mL pH6.5。然后，用紫外線及EMS對(duì)G5進(jìn)行誘變育種。結(jié)果證明EMS誘變效果較好。G5經(jīng)EMS誘變后傳代3次，酶活比出發(fā)菌株提高了168.6％。 我們根據(jù)G. geotrichum脂肪酶基因核酸序列的保守區(qū)域，利用熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR(TAIL-

4、PCR)技術(shù)擴(kuò)增得到了G5脂肪酶基因的全序列，此基因沒(méi)有內(nèi)含子，全長(zhǎng)1692bp，編碼563個(gè)氨基酸，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。 最后，對(duì)固定化的G5脂肪酶在有機(jī)相中催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)進(jìn)行了嘗試，此酶可以轉(zhuǎn)化橄欖油、棉籽油、煎炸廢油等多種底物生產(chǎn)生物柴油，對(duì)橄欖油的酯化率達(dá)到54％。在有機(jī)相中還利用此G5脂肪酶對(duì)生物表面活性劑槐糖脂進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，對(duì)修飾后的槐糖化酶脂的抑菌活性進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)修飾提高了其對(duì)石膏樣毛癬菌和紅