痕量鄰苯二甲酸酯類塑化劑的新型免疫分析方法的研究.pdf

1、塑化劑主要是指鄰苯二甲酸酯類化合物（Phthalic acid esters，PAEs），又稱酞酸酯類，能增加女性患乳腺癌的概率、影響男子的生殖能力、引起兒童性早熟、危害兒童的肝臟和腎臟等，進(jìn)而威脅人體健康。目前，檢測PAEs的方法主要有色譜分析法、色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析法、熒光分析法、分光光度法等，但這些方法要求樣品高純度、所需檢測成本偏高、檢測批量樣品耗時(shí)長，上述方法無法實(shí)現(xiàn)對(duì)批量樣品進(jìn)行快速高通量的現(xiàn)場檢測分析。然而，免疫分析檢測方法比

2、儀器檢測方法操作簡單，具有高靈敏、高特異性等優(yōu)點(diǎn)。因此，本文旨在研究建立高效快速、高靈敏、高通量的新型免疫分析方法檢測各類介質(zhì)樣品中的PAEs，以滿足對(duì)痕量PAEs的檢測需求。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）本論文研究選擇在全球范圍內(nèi)常用且關(guān)注度較高的鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）和鄰苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）為 PAEs的代表物質(zhì)，通過末端修飾氨基改造其分子結(jié)構(gòu)從而

3、制備半抗原，經(jīng)熔點(diǎn)測試、紫外光譜（UV）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、核磁共振氫譜（NMR）等方法表征驗(yàn)證了其分子結(jié)構(gòu)。以牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）為載體蛋白，采用重氮化法和戊二醛法將半抗原分別偶聯(lián)到載體蛋白BSA、OVA表面，制備了四種人工免疫原（BSA-DMP、BSA-DEP、BSA-DBP、BSA-DEHP）和四種人工包被原（OVA-DMP、OVA-DEP、OVA-DBP、OVA-DEHP）。然后，人工免疫原

4、與適當(dāng)佐劑充分乳化后免疫38日齡的雄性新西蘭大白兔，經(jīng)過為期3.5月的免疫后，從兔血清中分離獲得了4種分別抗 DMP、抗 DEP、抗 DBP和抗 DEHP的多克隆抗體，所得的抗體特異性較好（交叉反應(yīng)率＜10%），效價(jià)均高達(dá)到110000倍以上。
　　（2）以生物素-N-琥珀酰亞胺基酯（BNHS）為生物素衍生試劑標(biāo)記抗 DMP、抗 DEP、抗 DBP和抗 DEHP的多克隆抗體，并利用生物素-親和素信號(hào)放大系統(tǒng)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（EL

5、ISA）相結(jié)合，經(jīng)過優(yōu)化結(jié)合條件，分別建立了檢測DMP、DEP、DBP和 DEHP的間接競爭生物素-親和素-酶聯(lián)免疫吸附法（BA-ELISA）。在最佳條件下，檢測 DMP的線性范圍為0.024-6.027μg/L，靈敏度為0.356μg/L，檢測下限為0.0082μg/L；檢測DEP的線性范圍為0.021-9.512μg/L，靈敏度為0.443μg/L，檢測下限為0.0079μg/L；檢測 DBP的線性范圍為0.015-8.895μg/

6、L，靈敏度為0.361μg/L，檢測下限為0.0053μg/L；檢測DEHP的線性范圍為0.021-12.948μg/L，靈敏度為0.526μg/L，檢測下限為0.0074μg/L。上述檢測方法板內(nèi)和板間變異系數(shù)均小于12%，表明該方法重復(fù)性較好，且方法的靈敏度比傳統(tǒng) ELISA方法提高了5-8倍。采用該方法檢測三種不同介質(zhì)樣品中DMP、DEP、DBP和 DEHP的含量，檢測結(jié)果與氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）相一致；樣品加標(biāo)回收率分別

7、為88.1%-109%（DMP）、93.5%-108%（DEP）、89.5%-110%（DBP）、90.7%-111%（DEHP），變異系數(shù)分別為5.69%-10.3%（DMP）、5.49%-11.5%（DEP）、5.68%-11.9%（DBP）、6.64%-11.1%（DEHP）。
　?。?）以BNHS為生物素衍生試劑標(biāo)記 DNA片段制備生物素化DNA，并利用生物素-親和素信號(hào)放大系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量免疫 PCR技術(shù)（rt-IPC

8、R）方法相結(jié)合，優(yōu)化了各所需檢測試劑的濃度，分析了基質(zhì)效應(yīng)的影響，分別建立了檢測DMP、DEP、DBP和 DEHP的直接競爭生物素-親和素-實(shí)時(shí)熒光定量免疫 PCR方法（BA-rt-IPCR）。通過擴(kuò)增103 bp的目的DNA來間接實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原抗體識(shí)別反應(yīng)的信號(hào)檢測。在最優(yōu)條件下，檢測DMP的濃度范圍為10 pg/L-100 ng/L時(shí)線性關(guān)系良好，R2=0.9846，檢測下限為1.98 pg/L；當(dāng) DEP濃度為10 pg/L-100

9、ng/L時(shí)線性關(guān)系良好，R2=0.9716，檢測下限為4.85 pg/L；當(dāng) DBP濃度為10 pg/L-50 ng/L時(shí)線性關(guān)系良好，R2=0.9650，檢測下限為2.27 pg/L；當(dāng) DEHP濃度為10 pg/L-50 ng/L時(shí)線性關(guān)系良好，R2=0.9751，檢測下限為2.05 pg/L；上述檢測方法的板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%，表明該方法穩(wěn)定性較好。采用該 BA-rt-IPCR方法檢測三種不同介質(zhì)樣品中 DMP、DEP、

10、DBP和 DEHP的含量；檢測結(jié)果與GC-MS一致。樣品加標(biāo)回收率分別為91.8%-106%（DMP）、89.5%-108%（DEP）、91.3%-109%（DBP）、89.4%-110%（DEHP），變異系數(shù)分別為5.56%-11.8%（DMP）、5.69%-12.7%（DEP）、5.78%-13.2%（DBP）、4.87%-12.5%（DEHP）。此外，與間接競爭 BA-ELISA方法相比，該方法的檢測下限降低了近1500-4000

11、倍不等。
　　（4）利用還原檸檬酸鈉法制備了粒徑為15 nm的金納米顆粒（GNPs），將抗DMP、抗 DEP、抗 DBP和抗 DEHP的多克隆抗體分別和巰基修飾 DNA標(biāo)記在GNPs表面，成功制備了條形碼 DNA-金納米-抗體復(fù)合物探針（Barcode DNA-GNPs-pAb）。再采用生物條形碼技術(shù)（Bio-barcode）技術(shù)與 rt-IPCR技術(shù)相結(jié)合，經(jīng)過優(yōu)化引物濃度、退火溫度、Barcode DNA-GNPs-pAb與人

12、工包被原的濃度比、封閉液的封閉效果以及不同基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)等因素后，分別建立了檢測 DMP、DEP、DBP和 DEHP的直接競爭 GNP-rt-IPCR分析方法。以條形碼 DNA（Barcode DNA）的擴(kuò)增來間接實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原抗體識(shí)別反應(yīng)的信號(hào)檢測。在最優(yōu)條件下，當(dāng) DMP濃度為5 pg/L-50000 pg/L時(shí)線性關(guān)系良好，R2=0.9807，檢測下限為1.38 pg/L；當(dāng) DEP濃度為4 pg/L-40000 pg/L時(shí)線性關(guān)系良

13、好，R2=0.9756，檢測下限為1.06 pg/L；當(dāng) DBP濃度為5 pg/L-5000 pg/L時(shí)線性關(guān)系良好，R2=0.9709，檢測下限為1.23 pg/L；當(dāng) DEHP濃度為6 pg/L-6000 pg/L時(shí)線性關(guān)系良好，R2=0.9662，檢測下限為1.57 pg/L；上述檢測方法的板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。采用該 GNP-rt-IPCR分析方法檢測三種不同介質(zhì)樣品中 DMP、D

14、EP、DBP和 DEHP的含量，檢測結(jié)果與 GC-MS相一致；應(yīng)用該方法高通量檢測15個(gè)實(shí)際樣品，檢測周期為4.5 h，遠(yuǎn)小于GC-MS方法的檢測周期（75 h）；此外，該方法的樣品預(yù)處理方法簡單，正常萃取后不需要預(yù)濃縮甚至樣品的純化，可以省去每個(gè)樣品的長達(dá)30 min的預(yù)濃縮時(shí)間。該方法檢測 DMP、DEP、DBP和 DEHP的樣品加標(biāo)回收率分別為89.8%-109%（DMP）、88.8%-111%（DEP）、90.1%-109%（D

15、BP）、87.9%-109%（DEHP），變異系數(shù)分別為5.65%-12.9%（DMP）、4.89%-12.3%（DEP）、4.26%-11.6%（DBP）、4.96%-13.1%（DEHP）。與直接競爭 BA-rt-IPCR分析方法相比，直接競爭 GNP-rt-IPCR分析方法的檢測下限降低了0.5-4倍。
　　建立的三種新型免疫分析方法均具有高效快速、高靈敏、高特異性、操作簡便快捷、高重復(fù)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。檢測三種不同介質(zhì)的實(shí)際樣