HM-EO-Triton X-114-IDa-Cu(Ⅱ)雙水相膠束系統(tǒng)構(gòu)建及其分配技術(shù)的研究.pdf

1、雙水相膠束系統(tǒng)(ATPMS)是一種有前途的液液萃取技術(shù)可有效用于生物分離。實驗構(gòu)建一種新型親和作用主導(dǎo)的雙水相膠束系統(tǒng)，以提高生物分子的萃取特異性，并考察該系統(tǒng)實際應(yīng)用的可行性。論文從以下幾部分進行研究:帶親和配基的表面活性劑TritonX-114-IDA-Cu(Ⅱ)的合成、親和雙水相膠柬系統(tǒng)液液相平衡的研究，以及利用該系統(tǒng)分離純化蛋白質(zhì)的應(yīng)用研究。
　　以非離子型表面活性劑Triton X-114(TX)為載體，通過環(huán)氧氯丙烷(

2、ECH)法進行羥基活化;然后TX-環(huán)氧化物在堿性條件下偶聯(lián)亞氨基二乙酸(IDA)，經(jīng)氯仿萃取并真空干燥處理，合成得到TX-IDA;最后將TX-IDA與銅離子螯合，得到Triton X-114-IDA-Cu(Ⅱ)(TX-Cu(Ⅱ))，并且對制備工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳活化條件為n(ECH)∶n(TX)=1.5∶1，n(BF3)∶n(TX)=1∶20，冰水浴反應(yīng)18h，然后在n(NaOH)∶n(TX)=2∶1摩爾比下加入10mol/L

3、NaOH溶液，反應(yīng)4h，環(huán)氧產(chǎn)物得率為79.1％;最佳偶聯(lián)反應(yīng)條件為上述反應(yīng)液中以n(IDA)∶n(TX)=1.5∶1配比加入IDA，調(diào)節(jié)pH=12.5，在55℃下反應(yīng)20h，合成得到TX-IDA，IDA偶聯(lián)率為74.5％;TX-IDA與Cu2+的螫合反應(yīng)容易進行，n(Cu2+)∶n（TX)=1∶1,室溫反應(yīng)6h，得到金屬螯合表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)，螯合率為90.5％，收率為65.2％。
　　在巢狀疏水改性聚氧乙烯(HM-EO

4、)形成的一元ATPMS中，引入合成帶親和配基的小分子表面活性劑TX-Cu(Ⅱ)，構(gòu)成親和作用主導(dǎo)的二元雙水相膠束系統(tǒng)HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)。考察了新系統(tǒng)液液相平衡性質(zhì)，研究顯示，TX-Cu(Ⅱ)與HM-EO能夠形成混合膠束簇集體，并且新系統(tǒng)在較低溫度(4℃)即可自發(fā)分相。溫度升高可以增大系統(tǒng)兩相區(qū)域;降低體系pH有利于系統(tǒng)分相;添加無機鹽促使混合膠束網(wǎng)絡(luò)的形成以及相分離更加容易，陽離子有利于系統(tǒng)分相的次序為K+＞Na+，陰離子為:

5、SO42-＞Cl-＞Br-＞I-。
　　考察BSA與溶菌酶兩種模型蛋白在新構(gòu)建的親和ATPMS中分配情況。結(jié)果表明，雙水相膠束系統(tǒng)中，BSA與溶菌酶受體積排阻效應(yīng)等因素主要分配于膠束缺失相。隨著主成相劑HM-EO含量升高，兩種蛋白的分配系數(shù)均呈上升趨勢;調(diào)節(jié)溶液pH能夠改變蛋白質(zhì)表面所帶電荷數(shù)，影響分配系數(shù);溫度升高有利于聚皂膠束形成，增加下相體積排阻效應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分配系數(shù)的升高。然而，較高溫度易導(dǎo)致酶失活或者變性，不利于酶

6、活回收率;增大溶液電導(dǎo)率，能夠減弱蛋白質(zhì)與膠束間靜電排斥作用，進而影響蛋白質(zhì)分配系數(shù)，但對酶活回收率影響較小。考察了親和配基濃度對模型蛋白在新構(gòu)建系統(tǒng)中分配的影響。結(jié)果表明，隨著TX-Cu(Ⅱ)在系統(tǒng)中含量的增加，BSA分配系數(shù)逐漸升高，而溶菌酶呈降低趨勢。并且，TX-Cu(Ⅱ)濃度在0-1.0％時，對酶的活性影響較小。
　　研究了帶六聚組氨酸標簽的重組蛋白3'，5'-二磷酸核苷酸酶(YND)在HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)中的

7、分配行為，考察親和ATPMS對富組氨酸蛋白分離純化的可行性。結(jié)果表明，TX-Cu(Ⅱ)能夠增強ATPMS對富組氨酸蛋白的萃取選擇性，YND與TX-Cu(Ⅱ)親和結(jié)合而被優(yōu)先分配于膠束富集相并且在混合膠束系統(tǒng)中顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性，而雜蛋白傾向于分配到膠束缺失相從而被去除。將親和雙水相膠束系統(tǒng)直接用于萃取發(fā)酵液中YND，結(jié)果顯示，前萃取中，YND在膠束富集相的酶活回收率為63.58％，純化倍數(shù)為1.42;經(jīng)過反萃取，YND由膠束富集相轉(zhuǎn)而分

8、配進入膠束缺失相，并獲得49.23％的酶活回收率，純化倍數(shù)增加到2.63。因此，實驗構(gòu)建的HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)系統(tǒng)可以有效用于對富組氨酸蛋白YND的分離純化。
　　實驗構(gòu)建了新型的親和雙水相混合膠束系統(tǒng)HM-EO/TX-Cu(Ⅱ)，并對其液液相平衡以及模型蛋白(BSA、溶菌酶)在該體系中的分配行為進行了研究。在此研究基礎(chǔ)之上，將構(gòu)建的親和雙水相膠束系統(tǒng)成功用于對發(fā)酵液中YND的分離純化，證明了親和ATPMS在富組氨酸蛋白分