基于聚乙烯亞胺包裹的納米金顆粒對PCR的優(yōu)化研究及其在基因傳遞中的研究.pdf

1、隨著納米科技的快速發(fā)展，采用納米技術制備的納米材料成為了當前的研究熱點。納米材料由于具有特殊的物理化學性質(zhì)，已經(jīng)被廣泛應用于生物醫(yī)學領域，并取得了很多有價值的應用成果。聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR技術）是一種基于DNA擴增的分子生物學技術，也是臨床醫(yī)學中的檢測疾病的重要手段，但是PCR擴增中時常出現(xiàn)的低效率和非特異性問題限制了該技術的廣泛應用?！凹{米PCR”概念的引進為PCR技術的完善提供了

2、一種獨特的思路。此外，基因治療（Gene therapy）作為一種新型的治療疾病的方法被認為是藥學和醫(yī)學領域的一次革命。與傳統(tǒng)治療方法相比，基因治療有望從根本上治療疾病，已成為目前國際學術界研究的焦點。然而，基因傳遞中使用的基因傳遞載體經(jīng)常具有很高的毒性或者較低的轉(zhuǎn)染效率，以納米材料為代表的非病毒載體逐漸成為科學家們研究的“新寵”。
　　本碩士論文主要是以超支化聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）包裹的納米金顆粒

3、作為優(yōu)化劑應用于PCR技術，并探討其優(yōu)化機理，同時作為一種負載外源正?；虻膫鬟f載體應用于基因治療的研究。我們希望通過本論文的研究，開發(fā)出一種既可以優(yōu)化 PCR技術又能作為理想的基因傳遞載體的多功能性的納米材料。
　　在第二章中，首先我們通過選擇價廉易得的PEI作為樹狀大分子的替代品，在PEI表面修飾聚乙二醇（mPEG），用來提高納米材料的穩(wěn)定性和生物相容性。并以此為模板，利用硼氫化鈉還原法，調(diào)控氯金酸與PEI的投料摩爾比，從而調(diào)

4、控納米材料的結(jié)構，表面電勢和粒徑大小，最終合成了一系列包裹不同數(shù)量納米金顆粒的 PEGAu PENPs（PEGylated PEI-entrapped Entrapped Gold Nanoparticles）。另外，通過表征數(shù)據(jù)可知：所合成的PEGAu PENPs粒徑較小、分布均勻、具有良好的生物相容性和較高的熱導率。
　　在第三章中，根據(jù)相關文獻，我們首先建立了兩種 PCR擴增體系：二輪易錯PCR反應體系和高GC含量（74％G

5、C含量）PCR反應體系。然后以這兩種體系作為 PCR優(yōu)化劑的篩選平臺，通過一系列優(yōu)化實驗和凝膠電泳實驗來評估PEGAu PENPs的優(yōu)化能力。此外，我們通過系統(tǒng)的實驗設計，進一步探討了納米材料對 PCR技術的優(yōu)化機理。結(jié)果表明：所有的PEGAu PENPs都可以提高PCR反應的效率和特異性。值得指出的是，我們發(fā)現(xiàn)納米材料在不同的 PCR體系中，可能展示著不同的優(yōu)化機理。在二輪易錯PCR體系中，PEGAu PENPs的優(yōu)化作用可能是由于其

6、表面電荷介導的靜電作用所導致的；而在高GC含量PCR體系中，PEGAu PENPs的良好的熱傳遞性能可能是優(yōu)化PCR反應的主要原因。
　　在第四章中，我們首先通過凝膠阻滯實驗測試了PEGAu PENPs壓縮pDNA的能力，然后通過增強型綠色熒光蛋白（EGFP）基因和熒光素酶（Luc）基因的表達實驗來衡量材料的轉(zhuǎn)染效率。最后，通過流式細胞術以及材料/pDNA復合物在細胞內(nèi)的定位實驗進一步研究了材料的轉(zhuǎn)染機理。結(jié)合第二章的細胞毒性實驗