基于聚乙烯亞胺為骨架的非病毒轉(zhuǎn)基因載體的研究.pdf

1、基因治療是指將人體正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入人體靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用,從而達(dá)到治療疾病目的的治療方式.本研究的目的在于改造PEI,構(gòu)建具有高轉(zhuǎn)基因效率、低毒性、具有腫瘤細(xì)胞和組織的特異靶向性以及適合體內(nèi)靜脈途徑使用的轉(zhuǎn)基因載體.整個(gè)研究分成三部分,在以分子量為25 kDa的PEI(PEI25k)為骨架的基礎(chǔ)上,分別通過(guò)雙靶向配體肽偶聯(lián)、PEG化以及以多臂PEG為核心偶聯(lián)低分子量PEI三種修飾策略,設(shè)計(jì)了

2、3類(lèi)新型載體.詳細(xì)研究了載體的合成過(guò)程、理化特性、縮合質(zhì)粒DNA的能力、體內(nèi)外毒性、體外相應(yīng)細(xì)胞株中的轉(zhuǎn)基因效率、特異細(xì)胞的靶向作用以及在體內(nèi)荷瘤動(dòng)物模型中的轉(zhuǎn)基因活性,以期得到可以在腫瘤的基因治療中發(fā)揮重要作用的理想載體并部分闡明其轉(zhuǎn)基因的機(jī)制. 在第一部分研究中,鑒于大部分腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptors,FGFR)和整合素(integrinl)

3、,作者選擇了靶向于FGFR的多肽YRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKC(YC25)和靶向于整合素的含RGD肽CYGGRGDTP(CP9)兩條肽,分別偶聯(lián)到PEl25k上,構(gòu)建了雙受體靶向的載體(YC25-PEI-CP9),觀(guān)察合成的載體是否具有轉(zhuǎn)基因效率提高并有特異細(xì)胞的靶向性等優(yōu)點(diǎn).在該部分研究中,先利用細(xì)胞免疫組織化學(xué)的方法和FITC標(biāo)記的YC25肽篩選出了FGFR陽(yáng)性的COS-7、HeLa細(xì)胞和FGFR陰性的PC-3細(xì)

4、胞作為研究的工具細(xì)胞.在FTIR圖譜和紫外吸收?qǐng)D譜上,1630 cm<'-1>處的吸收峰和270 nm附近的吸收峰出現(xiàn)提示肽的成功偶聯(lián).通過(guò)計(jì)算<'1>H NMR圖譜上甲基基團(tuán)中質(zhì)子峰、苯環(huán)中質(zhì)子峰以及PEI中質(zhì)子峰的積分,驗(yàn)證了雙靶向載體中YC25和CP9與PEl25k的偶聯(lián)率分別為3.6和6.4.凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)證明了YC25-PEI-CP9在N/P比為4的時(shí)候可以完全縮合質(zhì)粒DNA.利用透射電鏡發(fā)現(xiàn)N/P比為10的時(shí)候,YC25-

5、PEI-CP9可以將質(zhì)粒DNA縮合成粒徑約為200 nm的類(lèi)圓形納米粒(polyplexes).Polyplexes的粒徑通過(guò)進(jìn)一步的粒徑測(cè)定驗(yàn)證.表面電荷測(cè)定結(jié)果表明在N/P比為10的時(shí)候,YC25-PEI-CP9和質(zhì)粒DNA形成的polyplexes的表面電荷為30.9±3.6 mV.在COS-7細(xì)胞中的MTT毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明YC25-PEI-CP9毒性略低于PE125k.在COS-7細(xì)胞和HcLa細(xì)胞中的體外轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn)YC2

6、5-PEI-CP9在N/P比為10的時(shí)候,具有最高的效率,不僅要遠(yuǎn)高過(guò)PE125k,也要高于單配體肽偶聯(lián)的PE125k.但在PC-3細(xì)胞中,以CP9肽單偶聯(lián)的PE125k效率最好.隨后在HeLa細(xì)胞中的游離肽抑制實(shí)驗(yàn)證明了偶聯(lián)的兩條肽的靶向作用. 在第二部分研究中,為了屏蔽PE125k表面陽(yáng)性電荷,降低載體毒性,使構(gòu)建的載體適合體內(nèi)使用,作者利用PEl25k為骨架,以分子量3400 Da的PEG作為電荷屏蔽基團(tuán),并結(jié)合特異靶向于

7、FGFR的肽GT10,構(gòu)建了偶聯(lián)率分別為1、2和4的PEG化的靶向載體PEI-PEG-GT10(1、2、4).在本部分研究中首先用FITC標(biāo)記的GTl0經(jīng)細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了NIH3T3、HepG2細(xì)胞可以和GT10結(jié)合,而PC-3細(xì)胞則不能,并用此三種細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)工具細(xì)胞使用.FTIR結(jié)果上1732 cm<'-1>處吸收峰的消失以及1658 cm<'-1>處吸收峰的出現(xiàn)提示合成過(guò)程的成功.通過(guò)<'1>H NMR結(jié)果驗(yàn)證了PEG以及

8、肽相對(duì)于PE125k的偶聯(lián)率分別為1、2和4.凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PEI-PEG-GT10在N/P比4～5以上時(shí)可以完全縮合質(zhì)粒DNA.粒徑檢測(cè)表明在N/P比>30的時(shí)候,PEI-PEG-GT10(1)可以將質(zhì)粒DNA縮合成粒徑為200 nm左右的納米粒,而且可以抵抗隨著時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致的聚集現(xiàn)象.透射電鏡觀(guān)察PEI-PEG-GT10與質(zhì)粒DNA在N/P比為30時(shí)形成類(lèi)圓形的納米粒,邊緣結(jié)構(gòu)偏疏松.其后的表面電荷測(cè)定結(jié)果表明在N/P比

9、為30時(shí),PEI-PEG-GT10形成的polyplexes表明電荷接近中性.體外毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PEI-PEG-GT10毒性要遠(yuǎn)低于PEI25k.體外在NIH3T3細(xì)胞中的篩選實(shí)驗(yàn)表明PEI-PEG-GT10(1)在N/P比為30的時(shí)候,具有最高的轉(zhuǎn)基因效率.在HepG2細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一點(diǎn),而在PC-3細(xì)胞中,GT10肽的偶聯(lián)未能顯示出更好的促轉(zhuǎn)基因作用.在NIH3T3細(xì)胞中的游離肽抑制實(shí)驗(yàn)證明了GT10肽的靶向作用.隨后的血清

10、體系轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)表明PEI-PEG-GT10(1)具有抵抗血清抑制轉(zhuǎn)基因的作用. 在第三部分研究中,鑒于低分子量PEI具有毒性低的特點(diǎn),結(jié)合PEG所具有的屏蔽陽(yáng)性電荷的作用,為了構(gòu)建轉(zhuǎn)基因效率高、低毒性并適合體內(nèi)應(yīng)用的載體,作者以8臂的PEG(8armPEG)為核心,將分子量為600 Da的PEI(PEl600)串聯(lián)成大分子量的聚合物(8armPEG-PEl600),并在PEl600上偶聯(lián)靶向于腫瘤細(xì)胞表面FGFR的肽MCll(

11、8armPEG-PEI600-MCll).通過(guò)FTIR檢測(cè)1730 cm<'-1>以及1670 cm<'-1>處吸收峰的生成和消減證明了偶聯(lián)的成功;通過(guò)TGA觀(guān)察成功合成的8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEl600-MCll的熱分解性質(zhì)發(fā)生了改變;其后通過(guò)GPC以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證了8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEl600-MCll的分子量,與理論值非常接近;而0H NMR的結(jié)果則進(jìn)一步證明了8ar

12、mPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MCll中各組件的偶聯(lián)率符合理論值. 凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8armPEG-PEl600和8armPEG-PEl600-MCll均在N/P比為3的時(shí)候,可以完全縮合質(zhì)粒DNA,而PEI600則需要N/P比達(dá)到4方可縮合質(zhì)粒DNA.通過(guò)粒徑和表面電荷的檢測(cè),可以發(fā)現(xiàn)在N/P比為30以上時(shí),8armPEG-PEl600和8armPEG-PEl600-MCll就可以將質(zhì)粒DNA縮合成約

13、200nm大小,表面電荷約為20 mV的納米粒.MTT的體外結(jié)果表明了8armPEG-PEI600、8armPEG-PEl600-MCll和PEI600相似,是毒性極低的聚合物.之后分別以HepG2和PC-3細(xì)胞為工具細(xì)胞,驗(yàn)證了合成的聚合物的轉(zhuǎn)基因效率.結(jié)果表明,在兩種細(xì)胞中,8armPEG-PEl600在N/P比為30的時(shí)候,均可以達(dá)到最好的效率,略低于N/P比為10時(shí)的PE125k.但是對(duì)于8armPEG-PE1600-MC11而

14、言,在HepG2細(xì)胞中,N/P比為30的時(shí)候,轉(zhuǎn)基因效率大幅上升,是PE125k的11倍,而在PC-3細(xì)胞中,則沒(méi)有這種效率增加效應(yīng). 綜上所述,本研究通過(guò)三種偶聯(lián)策略,成功地合成了FGFR和整合素雙靶向的PE125k載體、FGFR靶向的PEG化的PE125k載體以及8armPEG為核心的串聯(lián)小分子PE1600的并靶向于FGFR的載體.合成的新型載體都能夠在一定的條件下將質(zhì)粒DNA縮合成適合于轉(zhuǎn)基因的polyplexes,且具有

15、相應(yīng)受體陽(yáng)性細(xì)胞的靶向性,體外應(yīng)用具有轉(zhuǎn)基因效率高等特點(diǎn),體內(nèi)應(yīng)用有一定的效果.相對(duì)于PE125k而言,三類(lèi)載體各有優(yōu)點(diǎn),如均有體外轉(zhuǎn)基因效率高、靶向性好等特點(diǎn),但亦各有缺點(diǎn),如YC25-PEI-CP9毒性較大,相應(yīng)形成的polyplexes的高表面電荷使其不適合靜脈使用;PEG化的PE125k仍具有一定毒性,主骨架高分子量的PE125k無(wú)法降解;8armPEG為核心的載體形成的相應(yīng)polyplexes也是呈現(xiàn)相對(duì)高的表面陽(yáng)性電荷,影響

16、靜脈使用等.本研究橫跨有機(jī)化學(xué)、分析化學(xué)、高分子化學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)和腫瘤學(xué)等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域,多學(xué)科的結(jié)合為轉(zhuǎn)基因載體的開(kāi)發(fā)工作提供了嶄新的研究思路.研究中所選的靶向位點(diǎn)在腫瘤的靶向基因治療中具有良好的應(yīng)用前景.多種理化分析手段、靶向肽的設(shè)計(jì)和偶聯(lián)策略等內(nèi)容具有創(chuàng)新性.合成過(guò)程線(xiàn)路明確,重復(fù)性好,所需要的合成條件可行性好,為載體的大規(guī)模工業(yè)制備奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ).雖然合成的載體離理想轉(zhuǎn)基因載體的要求尚有一定距離,但相信通過(guò)進(jìn)一步完善載體