綠色工藝制備聚乙烯亞胺衍生物在細(xì)胞支架和介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染中的研究.pdf

1、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)作為典型的陽(yáng)離子聚合物之一，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程支架以及作為基因轉(zhuǎn)染的載體。由于PEI本身血液相容性較差，細(xì)胞毒性大等缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了其進(jìn)一步應(yīng)用。利用化學(xué)方法對(duì)PEI分子改性是一種有效降低其細(xì)胞毒性和改善血液相容性的方法。生物材料通過靜電紡絲技術(shù)制備的具有極大比表面積的納米纖維可以很好地模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞的粘附、增殖及為生理功能提供良好的微環(huán)境。
　　本論文結(jié)合兩

2、性離子化合物良好的生物相容性優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)合成兩性離子化合物PEI衍生物。利用高壓靜電紡絲技術(shù)制備PEI-C/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)的低毒復(fù)合納米纖維，考察其纖維性能和細(xì)胞毒性；研究改性后的PEI(PEI-C)作為基因載體時(shí)在水溶液中與質(zhì)粒DNA(Plasmid deoxyribonucleic acid, pDNA)之間的相互作用、納米復(fù)合物的形成、載體的生物相容性、細(xì)胞毒性及基因復(fù)合物在體外的轉(zhuǎn)染等性能

3、。
　　本論文的研究?jī)?nèi)容主要分為以下幾個(gè)方面：
　?。?）利用綠色化學(xué)的理念，基于富氨基類聚合物對(duì)二氧化碳有很強(qiáng)的吸附性這一特點(diǎn)，結(jié)合兩性離子化合物良好的生物相容性的優(yōu)勢(shì)，用二氧化碳對(duì)超支化PEI25KDa進(jìn)行改性，制備出聚乙烯亞胺衍生物(PEI-C)。通過核磁（NMR）、元素含量檢測(cè)和傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（FT-IR）對(duì)所制備的衍生物進(jìn)行表征確認(rèn)其結(jié)構(gòu)?？疾於趸嘉諘r(shí)間、PEI反應(yīng)濃度等影響因素，結(jié)果表明：PEI濃

4、度控制在20％~40％之間；當(dāng)二氧化碳在通入0.5h后，PEI中氧元素含量已達(dá)到27％。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，與未修飾的PEI25K相比， PEI-C材料的細(xì)胞的相對(duì)存活率維持在80％左右；而PEI的細(xì)胞毒性隨其濃度增加，細(xì)胞存活率從80％左右降低到30％以下，表明PEI-C的細(xì)胞毒性顯著降低。
　　（2）采用靜電紡絲手段，將PEI-C和PVA制備成具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復(fù)合納米纖維，用戊二醛蒸汽交聯(lián)得

5、到水穩(wěn)定的納米纖維膜。掃描電子顯微鏡（SEM）、FT-IR等手段表征其纖維膜交聯(lián)前后的形貌及結(jié)構(gòu)變化。通過對(duì)紡絲液濃度、電壓、接收距離和流速等條件的優(yōu)化，得到了具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復(fù)合納米纖維支架。以雪旺細(xì)胞（schwann cell）為模型細(xì)胞來(lái)研究該材料的生物相容性。研究表明，雪旺細(xì)胞在PEI-C/PVA復(fù)合纖維支架表面分布相比未改性的PEI/PVA復(fù)合纖維基質(zhì)更為密集，細(xì)胞形態(tài)明顯較好，更利于細(xì)胞生長(zhǎng)；

6、MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，PEI-C/PVA在質(zhì)量比為35：65時(shí)，纖維支架細(xì)胞的OD值為0.47，相當(dāng)于同等條件下PEI/PVA纖維支架OD值的2倍，證實(shí)改性后的復(fù)合纖維支架的細(xì)胞毒性明顯降低。
　?。?）將所制備的PEI-C材料用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的研究。蛋白吸附實(shí)驗(yàn)表明二氧化碳修飾后的PEI-C材料抵御蛋白質(zhì)吸附的能力增強(qiáng)；脫氧核糖核酸酶I的防護(hù)和釋放實(shí)驗(yàn)表明，PEI-C載體材料有保護(hù)pDNA免受細(xì)胞中核酸酶降解并且可以釋放

7、pDNA。使用凝膠電泳儀考察載體與pDNA的結(jié)合能力，采用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和Zeta電位儀考察載體與pDNA形成的復(fù)合物的粒徑和電位。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，與未修飾的PEI載體基因復(fù)合物(pDNA/PEI)相比，PEI-C載體基因復(fù)合物(pDNA/PEI-C)的細(xì)胞毒性顯著降低；體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，PEI-C能夠有效地介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染。以Hepa1-6細(xì)胞和QBC939細(xì)胞為模型細(xì)胞，在有血清情況下，PEI-C作為載體時(shí)在Hepa1-6