調(diào)控ATP和NADH-NAD+比例提高大腸桿菌琥珀酸的合成.pdf

1、琥珀酸是一種重要的平臺(tái)化合物，由于琥珀酸具有很大的應(yīng)用潛力，它被認(rèn)定為最重要的生物基大宗化學(xué)品之一。在大腸桿菌中提高琥珀酸合成的方法包括:阻斷競(jìng)爭(zhēng)性途徑、激活乙醛酸支路、過(guò)表達(dá)琥珀酸生產(chǎn)的關(guān)鍵酶以及提高能量和還原當(dāng)量的供應(yīng)等。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了一系列產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌，本文首次通過(guò)底物比例的調(diào)整，以及呼吸鏈的改造、ATP無(wú)效循環(huán)等一系列策略來(lái)調(diào)節(jié)菌株胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生和NADH/NAD+比例，達(dá)到提高琥珀酸產(chǎn)量和產(chǎn)率的目的。
　　葡萄

2、糖和木糖是纖維素水解液的主要成分，我們構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌YL104H可以以葡萄糖為底物高效的生產(chǎn)琥珀酸。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)YL104H也可以利用葡萄糖和木糖的混合糖來(lái)生產(chǎn)琥珀酸。然而，在發(fā)酵的厭氧階段以單一的木糖為底物時(shí)YL104H菌株不能積累琥珀酸，我們推測(cè)可能是由于以木糖作為底物時(shí)厭氧生產(chǎn)能量供應(yīng)不足導(dǎo)致的。通過(guò)分析以單一葡萄糖或單一木糖為底物時(shí)厭氧階段ATP的產(chǎn)生情況。我們發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)ATP的水平會(huì)影響琥珀酸的產(chǎn)量，通過(guò)簡(jiǎn)單的調(diào)節(jié)底

3、物中葡萄糖與木糖的比例就可以起到調(diào)節(jié)菌株胞內(nèi)ATP水平的作用。之前的研究都是通過(guò)增加ATP的供應(yīng)來(lái)提高琥珀酸的產(chǎn)量，本研究首次通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)ATP的產(chǎn)生達(dá)到最優(yōu)水平，以此來(lái)提高琥珀酸生產(chǎn)。YL104H菌株以不同比例的混合糖的發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖與木糖的比例為1∶2的時(shí)候琥珀酸產(chǎn)量最高。接著我們利用人工調(diào)配的最佳葡萄糖與木糖的比例進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)琥珀酸的產(chǎn)量可以達(dá)到一個(gè)比較高的水平。最后我們以木糖醇生產(chǎn)過(guò)程中得到的木糖廢液作為發(fā)酵

4、底物，YL104H菌株的琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到61.66 g/L，全階段的琥珀酸生產(chǎn)力為0.95 g/L/h。
　　實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的產(chǎn)琥珀酸工程菌株YL104也可以利用葡萄糖高效的生產(chǎn)琥珀酸，但全階段琥珀酸產(chǎn)率仍有待提高。在本研究中，我們探究了以葡萄糖為底物時(shí)菌株胞內(nèi)NADH/NAD+比例、ATP水平和全階段琥珀酸產(chǎn)率三者之間的關(guān)系。首先通過(guò)代謝工程改造使YL104菌株在有氧和厭氧階段均使用厭氧NADH脫氫酶，改造后的工程菌株全階段琥珀酸產(chǎn)

5、率提高了7％。為了進(jìn)一步降低轉(zhuǎn)厭氧時(shí)菌株胞內(nèi)的NADH/NAD+比例，我們?cè)赮L104N菌株中異源表達(dá)來(lái)自釀酒酵母胞質(zhì)可溶的延胡索酸還原酶FRDS，得到的工程菌株全階段琥珀酸產(chǎn)率提高了13％，菌株厭氧胞內(nèi)的NADH/NAD+比例與ATP水平都有所下降。我們還在厭氧階段采用ATP無(wú)效循環(huán)策略使菌株YL104NP厭氧琥珀酸產(chǎn)量有了明顯提高，全階段琥珀酸產(chǎn)率提高了17％。同時(shí)采用過(guò)表達(dá)異源的FRDS和ATP無(wú)效循環(huán)策略，菌株全階段琥珀酸產(chǎn)率達(dá)