好氧—厭氧產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構(gòu)建及全階段發(fā)酵設(shè)計的研究.pdf

1、琥珀酸是一種重要的平臺化合物，位于美國能源部選出的12種（組）具有高附加值的平臺化合物之首。作為兼性厭氧菌，現(xiàn)有的利用大腸桿菌工程菌株生產(chǎn)琥珀酸的策略有三種:好氧生產(chǎn)、厭氧發(fā)酵和好氧生長-厭氧發(fā)酵兩階段法等。鑒于這三個琥珀酸發(fā)酵策略的優(yōu)勢與瓶頸，我們構(gòu)建了一株在好氧、微好氧、及厭氧條件下均生產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌工程菌株，并開發(fā)了好氧-微好氧-厭氧全階段發(fā)酵策略。
　　解除低溶氧對琥珀酸好氧產(chǎn)生途徑的抑制。通過在好氧產(chǎn)琥珀酸菌株QZ1

2、111中敲除氧氣感應(yīng)系統(tǒng)ArcAB中ArcA組分的編碼基因arcA，獲得工程菌株QMJ03。QMJ03的琥珀酸產(chǎn)量提高81.65％，副產(chǎn)物乙酸的分泌量下降60％。QMJ03在對數(shù)生長期保持一個幾乎恒定的琥珀酸產(chǎn)生速率。在溶氧較低的對數(shù)生長后期，QMJ03中TCA循環(huán)和乙醛酸支路等途徑中相關(guān)基因較QZ1111均上調(diào)。arcA基因的敲除解除了低溶氧對好氧琥珀酸產(chǎn)生途徑中相關(guān)基因的抑制，有利于微好氧條件下琥珀酸的積累。
　　提高工程菌株

3、厭氧產(chǎn)琥珀酸能力。通過敲除大腸桿菌厭氧混合酸發(fā)酵中NADH利用的兩條代謝支路—乙醇脫氫酶和乳酸脫氫酶，得到工程菌株QMJ09。QMJ09的厭氧琥珀酸產(chǎn)量較QMJ03提高了2.5倍，而二者好氧琥珀酸產(chǎn)量相當(dāng)。這樣，我們成功構(gòu)建了一株好氧-厭氧產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌工程菌株。
　　再分配代謝流提高厭氧琥珀酸得率。通過在QMJ09基因組上對磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶編碼基因（pckA）的啟動子進(jìn)行了點突變(YL102)和在質(zhì)粒上過量表達(dá)NAD+

4、依賴的蘋果酸酶(pSCsfcA)，以增加磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸的羧化流量。厭氧階段的琥珀酸得率由0.95mol/molGlucose(QMJ09)提高到1.35mol/molGlucose(YL102/pSCsfcA)。
　　加快葡萄糖的跨膜運輸提高琥珀酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。組成型表達(dá)具有高速率、低能耗的運動假單胞桿菌來源的葡萄糖運輸載體GlfZm的編碼基因(trc-rbs-glfZm)，并整合到QMJ09和YL102的基因組上，分

5、別獲得工程菌株YL104和YL106，進(jìn)而獲得重組菌株YL104/pSCsfcA和YL106/pSCsfcA。操縱子trc-rbs-glfZm的基因組整合插入不僅提高了全階段葡萄糖的總利用量，而且提高了全階段琥珀酸的產(chǎn)量。這說明，加快碳源的跨膜轉(zhuǎn)運對于提高琥珀酸產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度是關(guān)鍵。其中，YL106/pSCsfcA的琥珀酸產(chǎn)量提高到34.40g/l，厭氧階段的琥珀酸得率達(dá)到1.57mol/molGlucose，全階段的琥珀酸得率為1.2

6、3mol/molGlucose。
　　開發(fā)好氧-微好氧-厭氧全階段琥珀酸發(fā)酵策略。在51發(fā)酵罐中通過控制通氣量對YL106/pSCsfcA進(jìn)行全階段發(fā)酵。在起始的好氧階段，細(xì)胞快速生長，發(fā)酵液中琥珀酸的積累基本上與菌株生長相偶聯(lián)。在微好氧階段，YL106/pSCsfcA以最大的生產(chǎn)強(qiáng)度積累了最多的琥珀酸。最后，通過停止通氣使發(fā)酵進(jìn)入自然厭氧階段。經(jīng)過40h全階段發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到85.30g/l，其總得率和總生產(chǎn)強(qiáng)度分別為0.9

7、9mol/mol和2.13g/l/h。該總生產(chǎn)強(qiáng)度是利用大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸中最高的。
　　一致化NADH脫氫酶提高工程菌株厭氧琥珀酸生產(chǎn)性能。通過敲除大腸桿菌好氧電子傳遞鏈中主要的兩個NADH脫氫酶(NDH-Ⅱ和WrbA)，使好氧琥珀酸生產(chǎn)和厭氧琥珀酸發(fā)酵中NADH電子傳遞鏈中NADH脫氫酶一致化。NADH脫氫酶一致化提高了厭氧階段葡萄糖消耗和琥珀酸的產(chǎn)量及得率，使厭氧階段與好氧階段琥珀酸產(chǎn)量比由0.74逐步提高到1.03和2.2

8、8，獲得具有提高的厭氧琥珀酸生產(chǎn)能力和穩(wěn)健的全階段琥珀酸生產(chǎn)性能的工程菌株YL104NW。
　　本論文還研究了失活細(xì)胞色素氧化酶Cytbo、組成型過表達(dá)琥珀酸產(chǎn)生途徑中與NADH利用相關(guān)的酶（蘋果酸酶SfcA和延胡索酸還原酶FrdABCD）、及組成型過表達(dá)厭氧琥珀酸發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵基因，對工程菌株好氧-厭氧全階段發(fā)酵過程中的厭氧琥珀酸發(fā)酵性能影響。
　　綜上所述，本論文構(gòu)建的在好氧、微好氧及厭氧條件下均能夠生產(chǎn)琥珀酸的大腸桿