漆酶催化性能的介質調控研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、漆酶是氧化酶,在污染物降解轉化以及生物燃料電池研發(fā)方面有著重要的應用價值。漆酶的蛋白屬性使得提高漆酶的活性和穩(wěn)定性成為上述領域中的關鍵之一。介質調控是改善酶催化性能的策略之一,尋找適合漆酶活力表達的介質或微環(huán)境能促進漆酶在生物催化轉化領域中的應用。
  水溶液是漆酶活力表達的重要場所。離子液體作為新興的介質具有揮發(fā)性小、性質可調、對很多物質有良好的溶解性等優(yōu)勢,它能改善水溶液中某些酶的催化性能。對于給定的酶(漆酶),系統(tǒng)研究不同離

2、子液體對其催化活性的影響并與酶構象關聯(lián),能為理性選擇合適的離子組合構建漆酶的兼容性介質提供理論指導。
  反膠束是酶促疏水底物轉化的理想介質。漆酶在反膠束中的催化活性有待提高,后者又依賴于反膠束的大小及其界面性質。金屬納米粒子具有結構剛性、形貌與尺寸可控等特點,利用金屬納米粒子來改變酶蛋白與表面活性劑界面的相互作用有助于對反膠束中漆酶催化性能進行調控。
  相比于反膠束,雙連續(xù)微乳液能提供更大的界面面積和更小的傳質阻力,是很

3、有前景的酶反應介質。以雙連續(xù)微乳液作為酶反應介質的報道不多且局限性于傳統(tǒng)油/水/表面活性劑體系。以疏水離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)油相構建離子液體基雙連續(xù)微乳液作漆酶反應介質是一個新嘗試?;谏鲜霰尘埃疚膰L試開展了如下幾方面工作:
  1.水溶液中離子液體對漆酶催化性能的調控研究
  離子液體與酶的作用機制很復雜。對給定的酶,不同陰陽離子及其組合對酶的活性及穩(wěn)定性影響不一樣。我們以2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽

4、(ABTS)為底物研究了漆酶在三種水溶性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸鹽([Bmim]TfO)、N,N-甲基丁基吡咯三氟甲磺酸鹽([Bmpyr]TfO)、四甲基銨三氟甲磺酸鹽([TMA]TfO)中的活性和放置穩(wěn)定性變化。用熒光和圓二色光譜跟蹤離子液體對漆酶構象的影響。結果發(fā)現(xiàn)高濃度[Bmim]TfO和[Bmpyr]TfO對漆酶有抑制和去穩(wěn)定化作用,隨孵育時間的延長這種作用更明顯。相反,[TMA]TfO是漆酶的穩(wěn)定劑,當該離子液

5、體濃度為1.0 M時,放置5天后漆酶殘余活力為初始活力的90%以上(對照實驗為40%)。離子液體對漆酶穩(wěn)定性的影響與它們在Hofmeister序列中的陽離子順序有關。對漆酶而言,[TMA]TfO不是激活劑,卻是好的穩(wěn)定劑。它能提高漆酶放置穩(wěn)定性的同時能保持漆酶的催化效率不變。上述研究為系統(tǒng)探討離子液體對漆酶的影響及其機制,探求適宜于漆酶催化的生物兼容性離子液體提供了理論依據。
  2.反膠束中金納米粒子對漆酶催化性能的調控研究

6、r>  反膠束的界面性質是影響酶催化活性的重要因素。在反膠束中添加金屬納米粒子有可能會調控酶與界面的相互作用進而調控酶活性。對不同電性質的反膠束而言,相同的納米材料對不同的酶可能會帶來不一樣的調控作用。本文用檸檬酸鈉還原的方法制備了不同粒徑的單分散的金納米粒子(GNP)并研究了AOT陰離子反膠束中GNP對漆酶催化活性的影響。結果發(fā)現(xiàn),盡管GNP在水溶液中對漆酶的活性和構象影響很小,但卻能明顯改變反膠束中漆酶的催化活性。GNP摻雜的反膠束

7、中漆酶活力依賴于GNP的濃度、粒徑、水含量及AOT的濃度。GNP加入反膠束后,表面活性劑分子在GNP周圍重新聚集形成新的反膠束,這些膠束與空的反膠束共存且各種膠束的比例受GNP和AOT濃度控制。熒光探針技術和動態(tài)光散射技術證明了GNP摻雜的反膠束的存在。漆酶的熒光和圓二色光譜表明,GNP通過改變反膠束結構來調控漆酶活力,反膠束水層厚度及AOT獨占面積是影響漆酶活性的主要因素。上述研究拓展并深化了對反膠束中酶催化活性的GNP調控機制的認識

8、,為漆酶最佳微環(huán)境的設計提供了理性指導。
  3.疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液中漆酶催化性能的介質效應
  3.1新型雙連續(xù)微乳液的構建與漆酶動力學研究
  疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液集離子液體與雙連續(xù)微乳液優(yōu)勢于一體,是很有前景的酶反應介質。利用魚形相圖法,本文選用聚氧乙烯型非離子表面活性劑,系統(tǒng)研究了表面活性劑、助醇、疏水離子液體對微乳液相行為的影響。結果表明,表面活性劑聚氧乙烯單元數(shù)越少、助醇(C5~C10)濃度越

9、高、疏水離子液體的Gordon參數(shù)值越小,微乳液體系的相轉變溫度((T))和表面活性劑效率越低。表面活性劑在疏水離子液體中的溶解/聚集、醇的界面效應及助溶劑效應是影響相行為的主要原因?;谏鲜鰧ο嘈袨榈恼J識,本文選擇了適當?shù)奈⑷橐后w系研究了漆酶的動力學參數(shù)的組成依賴效應和溫度效應。結果表明,助醇和溫度是影響漆酶催化性能的重要參數(shù)。常溫下,酶活力表達所需的最優(yōu)助醇鏈長及濃度依賴于微乳液中疏水離子液體的類型。在所選的微乳液體系中,[Omim

10、]NTf2/緩沖液/CnEm/1-己醇微乳液比較適合作漆酶反應介質;35.0℃時,在由C16E10穩(wěn)定的上述雙連續(xù)微乳液中漆酶的催化效率(95.3 mM-1min-1)是水飽和的[Omim]NTf2中漆酶催化效率(0.607 mM-1min-1)的157倍。這是第一篇構建疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液作酶反應介質的報道。
  3.2普通醇和氟碳醇對微乳液相行為及漆酶催化性能影響的對比研究
  醇作為一種重要的助劑在微乳液的形成與

11、結構調控方面有重要的作用。首次對比研究了中短鏈長(C2~C5)的普通醇和氟碳醇對聚氧乙烯型非離子表面活性劑穩(wěn)定的疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液相行為及其增溶漆酶催化性能的影響。相行為研究表明:氟碳醇的(C2~C5)烷基鏈長越短、濃度越高,(T)越低;這一趨勢與中長鏈長的普通醇(C5~C10)的影響規(guī)律相同。但普通醇對魚尾坐標的影響則比較復雜,短鏈醇(C2~C3)的烷基鏈越短、濃度越高,體系的(T)越高。上述差異與普通醇和氟碳醇性質的顯著差異

12、有關。研究過程中還發(fā)現(xiàn),氟碳醇和普通醇對體系相行為影響的差異依賴于疏水離子液體的組成。這一現(xiàn)象與助醇對疏水離子液體相性質的影響不同有關,后者決定了表面活性劑在疏水離子液體中的溶解和聚集,進而導致不同醇存在時,體系的(T)隨疏水離子液體組成變化的不同。35.0℃下漆酶動力學研究表明,普通醇體系中,漆酶在1-戊醇/C12E10/緩沖液/[Omim]PF6體系中的催化效率最高(124.3 mM-1min-1);而氟碳醇體系中,1H,1H-三氟

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