漆酶催化性能的介質(zhì)調(diào)控研究.pdf

1、漆酶是氧化酶，在污染物降解轉(zhuǎn)化以及生物燃料電池研發(fā)方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。漆酶的蛋白屬性使得提高漆酶的活性和穩(wěn)定性成為上述領(lǐng)域中的關(guān)鍵之一。介質(zhì)調(diào)控是改善酶催化性能的策略之一，尋找適合漆酶活力表達(dá)的介質(zhì)或微環(huán)境能促進(jìn)漆酶在生物催化轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中的應(yīng)用。
　　水溶液是漆酶活力表達(dá)的重要場(chǎng)所。離子液體作為新興的介質(zhì)具有揮發(fā)性小、性質(zhì)可調(diào)、對(duì)很多物質(zhì)有良好的溶解性等優(yōu)勢(shì)，它能改善水溶液中某些酶的催化性能。對(duì)于給定的酶（漆酶），系統(tǒng)研究不同離

2、子液體對(duì)其催化活性的影響并與酶構(gòu)象關(guān)聯(lián)，能為理性選擇合適的離子組合構(gòu)建漆酶的兼容性介質(zhì)提供理論指導(dǎo)。
　　反膠束是酶促疏水底物轉(zhuǎn)化的理想介質(zhì)。漆酶在反膠束中的催化活性有待提高，后者又依賴于反膠束的大小及其界面性質(zhì)。金屬納米粒子具有結(jié)構(gòu)剛性、形貌與尺寸可控等特點(diǎn)，利用金屬納米粒子來(lái)改變酶蛋白與表面活性劑界面的相互作用有助于對(duì)反膠束中漆酶催化性能進(jìn)行調(diào)控。
　　相比于反膠束，雙連續(xù)微乳液能提供更大的界面面積和更小的傳質(zhì)阻力，是很

3、有前景的酶反應(yīng)介質(zhì)。以雙連續(xù)微乳液作為酶反應(yīng)介質(zhì)的報(bào)道不多且局限性于傳統(tǒng)油/水/表面活性劑體系。以疏水離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)油相構(gòu)建離子液體基雙連續(xù)微乳液作漆酶反應(yīng)介質(zhì)是一個(gè)新嘗試?；谏鲜霰尘?，本文嘗試開(kāi)展了如下幾方面工作:
　　1.水溶液中離子液體對(duì)漆酶催化性能的調(diào)控研究
　　離子液體與酶的作用機(jī)制很復(fù)雜。對(duì)給定的酶，不同陰陽(yáng)離子及其組合對(duì)酶的活性及穩(wěn)定性影響不一樣。我們以2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽

4、(ABTS)為底物研究了漆酶在三種水溶性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸鹽([Bmim]TfO)、N，N-甲基丁基吡咯三氟甲磺酸鹽([Bmpyr]TfO)、四甲基銨三氟甲磺酸鹽([TMA]TfO)中的活性和放置穩(wěn)定性變化。用熒光和圓二色光譜跟蹤離子液體對(duì)漆酶構(gòu)象的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度[Bmim]TfO和[Bmpyr]TfO對(duì)漆酶有抑制和去穩(wěn)定化作用，隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)這種作用更明顯。相反，[TMA]TfO是漆酶的穩(wěn)定劑，當(dāng)該離子液

5、體濃度為1.0 M時(shí)，放置5天后漆酶殘余活力為初始活力的90％以上（對(duì)照實(shí)驗(yàn)為40％）。離子液體對(duì)漆酶穩(wěn)定性的影響與它們?cè)贖ofmeister序列中的陽(yáng)離子順序有關(guān)。對(duì)漆酶而言，[TMA]TfO不是激活劑，卻是好的穩(wěn)定劑。它能提高漆酶放置穩(wěn)定性的同時(shí)能保持漆酶的催化效率不變。上述研究為系統(tǒng)探討離子液體對(duì)漆酶的影響及其機(jī)制，探求適宜于漆酶催化的生物兼容性離子液體提供了理論依據(jù)。
　　2.反膠束中金納米粒子對(duì)漆酶催化性能的調(diào)控研究

6、r>　　反膠束的界面性質(zhì)是影響酶催化活性的重要因素。在反膠束中添加金屬納米粒子有可能會(huì)調(diào)控酶與界面的相互作用進(jìn)而調(diào)控酶活性。對(duì)不同電性質(zhì)的反膠束而言，相同的納米材料對(duì)不同的酶可能會(huì)帶來(lái)不一樣的調(diào)控作用。本文用檸檬酸鈉還原的方法制備了不同粒徑的單分散的金納米粒子(GNP)并研究了AOT陰離子反膠束中GNP對(duì)漆酶催化活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管GNP在水溶液中對(duì)漆酶的活性和構(gòu)象影響很小，但卻能明顯改變反膠束中漆酶的催化活性。GNP摻雜的反膠束

7、中漆酶活力依賴于GNP的濃度、粒徑、水含量及AOT的濃度。GNP加入反膠束后，表面活性劑分子在GNP周?chē)匦戮奂纬尚碌姆茨z束，這些膠束與空的反膠束共存且各種膠束的比例受GNP和AOT濃度控制。熒光探針技術(shù)和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)證明了GNP摻雜的反膠束的存在。漆酶的熒光和圓二色光譜表明，GNP通過(guò)改變反膠束結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)控漆酶活力，反膠束水層厚度及AOT獨(dú)占面積是影響漆酶活性的主要因素。上述研究拓展并深化了對(duì)反膠束中酶催化活性的GNP調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)

8、，為漆酶最佳微環(huán)境的設(shè)計(jì)提供了理性指導(dǎo)。
　　3.疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液中漆酶催化性能的介質(zhì)效應(yīng)
　　3.1新型雙連續(xù)微乳液的構(gòu)建與漆酶動(dòng)力學(xué)研究
　　疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液集離子液體與雙連續(xù)微乳液優(yōu)勢(shì)于一體，是很有前景的酶反應(yīng)介質(zhì)。利用魚(yú)形相圖法，本文選用聚氧乙烯型非離子表面活性劑，系統(tǒng)研究了表面活性劑、助醇、疏水離子液體對(duì)微乳液相行為的影響。結(jié)果表明，表面活性劑聚氧乙烯單元數(shù)越少、助醇(C5～C10)濃度越

9、高、疏水離子液體的Gordon參數(shù)值越小，微乳液體系的相轉(zhuǎn)變溫度（(T)）和表面活性劑效率越低。表面活性劑在疏水離子液體中的溶解/聚集、醇的界面效應(yīng)及助溶劑效應(yīng)是影響相行為的主要原因?；谏鲜鰧?duì)相行為的認(rèn)識(shí)，本文選擇了適當(dāng)?shù)奈⑷橐后w系研究了漆酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的組成依賴效應(yīng)和溫度效應(yīng)。結(jié)果表明，助醇和溫度是影響漆酶催化性能的重要參數(shù)。常溫下，酶活力表達(dá)所需的最優(yōu)助醇鏈長(zhǎng)及濃度依賴于微乳液中疏水離子液體的類(lèi)型。在所選的微乳液體系中，[Omim

10、]NTf2/緩沖液/CnEm/1-己醇微乳液比較適合作漆酶反應(yīng)介質(zhì);35.0℃時(shí)，在由C16E10穩(wěn)定的上述雙連續(xù)微乳液中漆酶的催化效率(95.3 mM-1min-1)是水飽和的[Omim]NTf2中漆酶催化效率(0.607 mM-1min-1)的157倍。這是第一篇構(gòu)建疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液作酶反應(yīng)介質(zhì)的報(bào)道。
　　3.2普通醇和氟碳醇對(duì)微乳液相行為及漆酶催化性能影響的對(duì)比研究
　　醇作為一種重要的助劑在微乳液的形成與

11、結(jié)構(gòu)調(diào)控方面有重要的作用。首次對(duì)比研究了中短鏈長(zhǎng)(C2～C5)的普通醇和氟碳醇對(duì)聚氧乙烯型非離子表面活性劑穩(wěn)定的疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液相行為及其增溶漆酶催化性能的影響。相行為研究表明:氟碳醇的(C2～C5)烷基鏈長(zhǎng)越短、濃度越高，(T)越低;這一趨勢(shì)與中長(zhǎng)鏈長(zhǎng)的普通醇(C5～C10)的影響規(guī)律相同。但普通醇對(duì)魚(yú)尾坐標(biāo)的影響則比較復(fù)雜，短鏈醇(C2～C3)的烷基鏈越短、濃度越高，體系的(T)越高。上述差異與普通醇和氟碳醇性質(zhì)的顯著差異

12、有關(guān)。研究過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，氟碳醇和普通醇對(duì)體系相行為影響的差異依賴于疏水離子液體的組成。這一現(xiàn)象與助醇對(duì)疏水離子液體相性質(zhì)的影響不同有關(guān)，后者決定了表面活性劑在疏水離子液體中的溶解和聚集，進(jìn)而導(dǎo)致不同醇存在時(shí)，體系的(T)隨疏水離子液體組成變化的不同。35.0℃下漆酶動(dòng)力學(xué)研究表明，普通醇體系中，漆酶在1-戊醇/C12E10/緩沖液/[Omim]PF6體系中的催化效率最高(124.3 mM-1min-1);而氟碳醇體系中，1H，1H-三氟