漆酶催化性能的介質(zhì)調(diào)控研究.pdf

1、漆酶是氧化酶，在污染物降解轉(zhuǎn)化以及生物燃料電池研發(fā)方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。漆酶的蛋白屬性使得提高漆酶的活性和穩(wěn)定性成為上述領(lǐng)域中的關(guān)鍵之一。介質(zhì)調(diào)控是改善酶催化性能的策略之一，尋找適合漆酶活力表達(dá)的介質(zhì)或微環(huán)境能促進(jìn)漆酶在生物催化轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中的應(yīng)用。
　　水溶液是漆酶活力表達(dá)的重要場所。離子液體作為新興的介質(zhì)具有揮發(fā)性小、性質(zhì)可調(diào)、對很多物質(zhì)有良好的溶解性等優(yōu)勢，它能改善水溶液中某些酶的催化性能。對于給定的酶（漆酶），系統(tǒng)研究不同離

2、子液體對其催化活性的影響并與酶構(gòu)象關(guān)聯(lián)，能為理性選擇合適的離子組合構(gòu)建漆酶的兼容性介質(zhì)提供理論指導(dǎo)。
　　反膠束是酶促疏水底物轉(zhuǎn)化的理想介質(zhì)。漆酶在反膠束中的催化活性有待提高，后者又依賴于反膠束的大小及其界面性質(zhì)。金屬納米粒子具有結(jié)構(gòu)剛性、形貌與尺寸可控等特點(diǎn)，利用金屬納米粒子來改變酶蛋白與表面活性劑界面的相互作用有助于對反膠束中漆酶催化性能進(jìn)行調(diào)控。
　　相比于反膠束，雙連續(xù)微乳液能提供更大的界面面積和更小的傳質(zhì)阻力，是很

3、有前景的酶反應(yīng)介質(zhì)。以雙連續(xù)微乳液作為酶反應(yīng)介質(zhì)的報(bào)道不多且局限性于傳統(tǒng)油/水/表面活性劑體系。以疏水離子液體代替?zhèn)鹘y(tǒng)油相構(gòu)建離子液體基雙連續(xù)微乳液作漆酶反應(yīng)介質(zhì)是一個(gè)新嘗試。基于上述背景，本文嘗試開展了如下幾方面工作:
　　1.水溶液中離子液體對漆酶催化性能的調(diào)控研究
　　離子液體與酶的作用機(jī)制很復(fù)雜。對給定的酶，不同陰陽離子及其組合對酶的活性及穩(wěn)定性影響不一樣。我們以2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽

4、(ABTS)為底物研究了漆酶在三種水溶性離子液體1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸鹽([Bmim]TfO)、N，N-甲基丁基吡咯三氟甲磺酸鹽([Bmpyr]TfO)、四甲基銨三氟甲磺酸鹽([TMA]TfO)中的活性和放置穩(wěn)定性變化。用熒光和圓二色光譜跟蹤離子液體對漆酶構(gòu)象的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度[Bmim]TfO和[Bmpyr]TfO對漆酶有抑制和去穩(wěn)定化作用，隨孵育時(shí)間的延長這種作用更明顯。相反，[TMA]TfO是漆酶的穩(wěn)定劑，當(dāng)該離子液

5、體濃度為1.0 M時(shí)，放置5天后漆酶殘余活力為初始活力的90％以上（對照實(shí)驗(yàn)為40％）。離子液體對漆酶穩(wěn)定性的影響與它們在Hofmeister序列中的陽離子順序有關(guān)。對漆酶而言，[TMA]TfO不是激活劑，卻是好的穩(wěn)定劑。它能提高漆酶放置穩(wěn)定性的同時(shí)能保持漆酶的催化效率不變。上述研究為系統(tǒng)探討離子液體對漆酶的影響及其機(jī)制，探求適宜于漆酶催化的生物兼容性離子液體提供了理論依據(jù)。
　　2.反膠束中金納米粒子對漆酶催化性能的調(diào)控研究

6、r>　　反膠束的界面性質(zhì)是影響酶催化活性的重要因素。在反膠束中添加金屬納米粒子有可能會調(diào)控酶與界面的相互作用進(jìn)而調(diào)控酶活性。對不同電性質(zhì)的反膠束而言，相同的納米材料對不同的酶可能會帶來不一樣的調(diào)控作用。本文用檸檬酸鈉還原的方法制備了不同粒徑的單分散的金納米粒子(GNP)并研究了AOT陰離子反膠束中GNP對漆酶催化活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管GNP在水溶液中對漆酶的活性和構(gòu)象影響很小，但卻能明顯改變反膠束中漆酶的催化活性。GNP摻雜的反膠束

7、中漆酶活力依賴于GNP的濃度、粒徑、水含量及AOT的濃度。GNP加入反膠束后，表面活性劑分子在GNP周圍重新聚集形成新的反膠束，這些膠束與空的反膠束共存且各種膠束的比例受GNP和AOT濃度控制。熒光探針技術(shù)和動態(tài)光散射技術(shù)證明了GNP摻雜的反膠束的存在。漆酶的熒光和圓二色光譜表明，GNP通過改變反膠束結(jié)構(gòu)來調(diào)控漆酶活力，反膠束水層厚度及AOT獨(dú)占面積是影響漆酶活性的主要因素。上述研究拓展并深化了對反膠束中酶催化活性的GNP調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識

8、，為漆酶最佳微環(huán)境的設(shè)計(jì)提供了理性指導(dǎo)。
　　3.疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液中漆酶催化性能的介質(zhì)效應(yīng)
　　3.1新型雙連續(xù)微乳液的構(gòu)建與漆酶動力學(xué)研究
　　疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液集離子液體與雙連續(xù)微乳液優(yōu)勢于一體，是很有前景的酶反應(yīng)介質(zhì)。利用魚形相圖法，本文選用聚氧乙烯型非離子表面活性劑，系統(tǒng)研究了表面活性劑、助醇、疏水離子液體對微乳液相行為的影響。結(jié)果表明，表面活性劑聚氧乙烯單元數(shù)越少、助醇(C5～C10)濃度越

9、高、疏水離子液體的Gordon參數(shù)值越小，微乳液體系的相轉(zhuǎn)變溫度（(T)）和表面活性劑效率越低。表面活性劑在疏水離子液體中的溶解/聚集、醇的界面效應(yīng)及助溶劑效應(yīng)是影響相行為的主要原因?；谏鲜鰧ο嘈袨榈恼J(rèn)識，本文選擇了適當(dāng)?shù)奈⑷橐后w系研究了漆酶的動力學(xué)參數(shù)的組成依賴效應(yīng)和溫度效應(yīng)。結(jié)果表明，助醇和溫度是影響漆酶催化性能的重要參數(shù)。常溫下，酶活力表達(dá)所需的最優(yōu)助醇鏈長及濃度依賴于微乳液中疏水離子液體的類型。在所選的微乳液體系中，[Omim

10、]NTf2/緩沖液/CnEm/1-己醇微乳液比較適合作漆酶反應(yīng)介質(zhì);35.0℃時(shí)，在由C16E10穩(wěn)定的上述雙連續(xù)微乳液中漆酶的催化效率(95.3 mM-1min-1)是水飽和的[Omim]NTf2中漆酶催化效率(0.607 mM-1min-1)的157倍。這是第一篇構(gòu)建疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液作酶反應(yīng)介質(zhì)的報(bào)道。
　　3.2普通醇和氟碳醇對微乳液相行為及漆酶催化性能影響的對比研究
　　醇作為一種重要的助劑在微乳液的形成與

11、結(jié)構(gòu)調(diào)控方面有重要的作用。首次對比研究了中短鏈長(C2～C5)的普通醇和氟碳醇對聚氧乙烯型非離子表面活性劑穩(wěn)定的疏水離子液體基雙連續(xù)微乳液相行為及其增溶漆酶催化性能的影響。相行為研究表明:氟碳醇的(C2～C5)烷基鏈長越短、濃度越高，(T)越低;這一趨勢與中長鏈長的普通醇(C5～C10)的影響規(guī)律相同。但普通醇對魚尾坐標(biāo)的影響則比較復(fù)雜，短鏈醇(C2～C3)的烷基鏈越短、濃度越高，體系的(T)越高。上述差異與普通醇和氟碳醇性質(zhì)的顯著差異

12、有關(guān)。研究過程中還發(fā)現(xiàn)，氟碳醇和普通醇對體系相行為影響的差異依賴于疏水離子液體的組成。這一現(xiàn)象與助醇對疏水離子液體相性質(zhì)的影響不同有關(guān)，后者決定了表面活性劑在疏水離子液體中的溶解和聚集，進(jìn)而導(dǎo)致不同醇存在時(shí)，體系的(T)隨疏水離子液體組成變化的不同。35.0℃下漆酶動力學(xué)研究表明，普通醇體系中，漆酶在1-戊醇/C12E10/緩沖液/[Omim]PF6體系中的催化效率最高(124.3 mM-1min-1);而氟碳醇體系中，1H，1H-三氟