Echinodontium taxodii漆酶理性固定策略及催化性能的研究.pdf

1、漆酶是一類催化酚類和非酚類化合物的聚合、分解及轉(zhuǎn)化，伴隨著單電子的轉(zhuǎn)移將分子氧還原成水的氧化還原酶。因其非特異性催化特征，使之在印染工業(yè)、造紙制漿工業(yè)、食品工業(yè)、生物檢測(cè)、生物修復(fù)、有機(jī)合成和生物能源等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。但是漆酶在環(huán)境中穩(wěn)定性、耐受性差等因素限制了其在工業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用，因此，研究提高漆酶催化性能的理論方法及技術(shù)策略很有必要。本文以一株高效木質(zhì)素選擇性降解白腐真菌紫杉木齒菌Echinodontium taxodii

2、及其所產(chǎn)漆酶為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究了該菌株漆酶的分泌條件、分離純化及基因克隆。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)方法理性預(yù)測(cè)并驗(yàn)證采用多糖側(cè)鏈親和吸附的定向固定化策略，并將定向固定化漆酶應(yīng)用于在水環(huán)境中富集對(duì)人體健康不利的磺胺類藥物催化性能的研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴以E.taxodii為出發(fā)菌株，基于對(duì)漆酶培養(yǎng)條件單因素研究結(jié)果，采取Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，對(duì)E. taxodii產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)基成分進(jìn)行

3、優(yōu)化，結(jié)果使漆酶活性達(dá)到23.66 U/mL。采用分級(jí)鹽析、疏水層析和離子交換層析等分離純化手段獲得電泳純的漆酶。發(fā)現(xiàn)純化漆酶在無介體體系下直接作用于毛竹木質(zhì)素（EMAL）的解聚反應(yīng)，解析了游離漆酶通過斷裂EMALβ-O-4醚鍵和甲氧基實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素解聚的催化性能。⑵利用銅離子保守區(qū)域設(shè)計(jì)漆酶簡(jiǎn)并引物，通過 RT-PCR和RACE技術(shù)，自 E. taxodii菌株中成功獲得編碼該漆酶蛋白的基因序列，預(yù)測(cè)其僅有三個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)。將結(jié)構(gòu)基因

4、轉(zhuǎn)入到畢赤酵母中，確證了該漆酶基因具有正確的生物學(xué)功能。⑶利用生物信息學(xué)方法同源建模得到E. taxodii漆酶的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)合該漆酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)、三維構(gòu)象和低糖基化，理性分析該漆酶蛋白表面氨基、羧基和多糖側(cè)鏈的數(shù)目、分布和與底物結(jié)合區(qū)域的距離，確定了低糖基化位點(diǎn)親和吸附的定向固定化為最佳的技術(shù)策略。將自制的粒徑為16.7 nm的氨基功能化磁性納米載體定向固定于漆酶中的多糖側(cè)鏈、氨基和羧基并進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明親和吸附在漆酶糖鏈上的

5、定向固定化效果最好，圓二色譜結(jié)果顯示通過糖鏈親和吸附能最小化改變漆酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步對(duì)固定化漆酶進(jìn)行酶學(xué)特性的研究，結(jié)果表明，與游離酶相比，糖鏈定向固定化漆酶（GAMNs-Con A-L）不僅熱穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性和批次穩(wěn)定性顯著改善，而且對(duì)底物 ABTS的親和力和催化反應(yīng)速率明顯增加，從而驗(yàn)證了理性固定技術(shù)策略的科學(xué)性及可行性。⑷分別以游離漆酶和GAMNs-Con A-L為催化劑，基于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元類型（S、G和H型）篩選出的S型

6、介體，進(jìn)一步研究漆酶對(duì)新型污染物磺胺類藥物的催化性能。 S型介體存在下，游離漆酶和GAMNs-Con A-L對(duì)磺胺類藥物的清除均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。定向固定化后提高了漆酶對(duì)底物的親和力和反應(yīng)催化效率，使GAMNs-ConA-L對(duì)磺胺類藥物的催化速率明顯增加。LC-EST-MS分析結(jié)果表明漆酶首先介導(dǎo) S型介體形成酚羥自由基，酚羥自由基進(jìn)而作用于磺胺類藥物苯環(huán)上的對(duì)位氨基并發(fā)生了雜合偶聯(lián)，形成了分子量均大于磺胺類藥物和介體的產(chǎn)物。抑菌性檢

7、測(cè)發(fā)現(xiàn)反應(yīng)后的藥液均失去了抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的活性。⑸以快速、理性制備高效固定化漆酶為出發(fā)點(diǎn)，在獲取E. taxodii漆酶和漆酶基因新資源的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法分析該漆酶的結(jié)構(gòu)特征及其在固定化過程中的最佳結(jié)合位點(diǎn)，驗(yàn)證研究結(jié)果表明該策略不僅能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)該漆酶的快速、便捷定向固定，而且提高了酶的催化性能，為木質(zhì)素降解酶的理性固定化提供了理論與技術(shù)基礎(chǔ)。通過探討不同木質(zhì)素結(jié)構(gòu)類型介體參與磺胺類藥物催化的關(guān)系，揭示了在基于木質(zhì)素