內生細菌Pantoea ananatisSd-1降解水稻秸稈性能與漆酶催化性質的研究.pdf

1、我國水稻秸稈資源豐富，但由于其難降解的特征，限制了其開發(fā)利用。利用微生物資源實現(xiàn)對水稻秸稈資源的降解研究，已日趨成為國內外學者關注的熱點。Pantoea ananatis Sd-1是本實驗室分離得到的一株具有高效降解水稻秸稈能力的水稻內生細菌，為了進一步探索 Sd-1降解水稻秸稈的條件及其對木質纖維素材料的降解機理，本文主要開展了以下三部分的研究。
　?。?）最佳條件探索與成分分析利用水稻秸稈為唯一碳源，通過單因素實驗與三因素三水

2、平的正交優(yōu)化實驗得到了Sd-1降解水稻秸稈的最佳組合條件為接種量1.5％、pH10、秸稈含量2.5%，在該條件下，Sd-1對秸稈的降解率為46%。以預處理水稻秸稈為唯一碳源，連續(xù)6天研究了Sd-1對預處理水稻秸稈的降解率，在第3天達到最大值61.8%。通過GC-MS分析預處理秸稈降解后發(fā)酵液的成分，鑒定出了一些構成木質素的低分子苯化合物（如苯酚、苯乙酸等）以及一些酸類物質。
　　（2）酶活變化與降解能力的研究定性培養(yǎng)基檢測，確定了

3、Sd-1具有分泌過氧化物酶、漆酶、纖維素酶和半纖維素酶的能力。以預處理秸稈為唯一碳源，連續(xù)6天檢測了上述四種木質纖維素降解酶在秸稈降解過程中的活性變化，發(fā)現(xiàn) Sd-1產(chǎn)木質素過氧化物酶、漆酶和纖維素酶的活性均在第3天達到最大值，分別為5.9 U/mL、600 U/L和295 U/mL，而產(chǎn)生的半纖維素酶在第一天即達到最大值1345 U/mL。通過對預處理秸稈中的木質纖維素組分含量的測定，發(fā)現(xiàn) Sd-1對秸稈中的木質素、纖維素和半纖維素的

4、降解率在第六天分別達到了35.62%、78.8%和75.2%。
　?。?）漆酶的克隆與純化通過對Sd-1全基因組的生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)四段CDS序列（lac1-lac4）可能編碼漆酶。進一步的進化樹分析、同源序列分析與三維結構分析，確定Lac4為典型的細菌漆酶。對Lac4進行克隆與原核表達，SDS-PAGE顯示其分子量約為60 kDa，Lac4酶活在以ABTS為底物時的最佳pH為2.5，在愈創(chuàng)木酚為底物時的pH為4.5。Lac4具

5、有極度耐酸性，金屬離子穩(wěn)定性且受到Fe2+與Cu2+顯著促進。 Lac4具有氧化非酚型（ABTS）和酚型（愈創(chuàng)木酚）化合物的能力，對ABTS的親和性 Km值達到1.03±0.154 mM。Lac4具有使染料脫色能力，尤其是能快速有效使剛果紅脫色，在有介質ABTS的存在下，其脫色率可達89%；Lac4在體外試驗中能使木質素的降解率達到38%，通過GC-MS分析Lac4降解木質素后的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了一些小分子的苯環(huán)化合物如苯酚、鄰苯二甲醛、苯二