自組裝抗腫瘤多肽的設(shè)計(jì)合成、表征和作用機(jī)制研究.pdf

1、癌癥是人類(lèi)健康的一大殺手，具有難以治愈、致死率高等特點(diǎn)。對(duì)于癌癥的治療，目前應(yīng)用最廣泛的小分子化療藥物往往具有溶解性不佳、細(xì)胞選擇性差、毒副作用明顯等缺點(diǎn)，且容易使細(xì)胞產(chǎn)生多重耐藥性，進(jìn)一步提高了腫瘤治療的難度。因此，人們亟待研發(fā)出一類(lèi)能夠有效解決或避免上述問(wèn)題的新型抗腫瘤藥物。
　　抗腫瘤多肽是一類(lèi)可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或者殺死腫瘤細(xì)胞的多肽，主要來(lái)源于抗菌肽。大多數(shù)抗腫瘤多肽都屬于裂解肽，其作用位點(diǎn)在細(xì)胞膜上，它們不需進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)

2、部即可裂解細(xì)胞膜殺死細(xì)胞，從而能夠有效克服細(xì)胞的多重耐藥性;同時(shí)，它的化學(xué)本質(zhì)是多肽，具有生物活性高、生物相容性好、合成方法成熟等優(yōu)點(diǎn)，因此，抗腫瘤多肽為腫瘤治療提供了新的方案。然而，抗腫瘤多肽也有許多缺點(diǎn)，如藥效有待提高、作用機(jī)制不明確、穩(wěn)定性差等，需要我們對(duì)其進(jìn)行針對(duì)性地優(yōu)化，以提升其應(yīng)用潛力。
　　分子自組裝行為廣泛存在于自然環(huán)境和生命體系中，具有自組裝能力的分子種類(lèi)繁多，多肽是其中一個(gè)重要的組成部分。多肽的自組裝過(guò)程受多種

3、非共價(jià)作用力的影響，且對(duì)環(huán)境條件的改變具有響應(yīng)性，因此它們被視為一類(lèi)“智能型”生物材料，在細(xì)胞培養(yǎng)、藥物載體、組織工程等方向均顯示出巨大的應(yīng)用潛力。自組裝行為對(duì)抗腫瘤多肽性質(zhì)和功能的改變也具有重要作用，它可以通過(guò)改變多肽的結(jié)構(gòu)和電荷分布而對(duì)抗腫瘤多肽的環(huán)境響應(yīng)性、細(xì)胞選擇性、穩(wěn)定性等方面產(chǎn)生影響，因而被視為抗腫瘤多肽的有效優(yōu)化手段。
　　為了解決抗腫瘤多肽的應(yīng)用問(wèn)題，我們嘗試從兩方面對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。一方面，我們對(duì)抗腫瘤多肽的細(xì)胞活性

4、進(jìn)行優(yōu)化，并深入了解其作用機(jī)制，在提高其抗腫瘤活性的同時(shí)，對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系進(jìn)行分析總結(jié)，為高效抗腫瘤多肽的設(shè)計(jì)和發(fā)展提供有益的指導(dǎo);另一方面，我們通過(guò)引入多肽自組裝，針對(duì)性地解決抗腫瘤多肽的穩(wěn)定性問(wèn)題，同時(shí)進(jìn)一步了解多肽的結(jié)構(gòu)、活性和穩(wěn)定性三者之間的關(guān)系，以期為無(wú)載體抗腫瘤多肽藥物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供有效方案。最后，我們利用多肽的自組裝性質(zhì)嘗試構(gòu)建一種環(huán)境響應(yīng)性多肽水凝膠材料，拓展自組裝多肽的應(yīng)用方向。
　　在本論文中，我們采

5、取生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等方面的實(shí)驗(yàn)手段，對(duì)抗腫瘤多肽序列進(jìn)行優(yōu)化并深入了解了其細(xì)胞作用機(jī)制，并將自組裝的思路引入了抗腫瘤多肽的優(yōu)化設(shè)計(jì)和環(huán)境響應(yīng)性生物材料的構(gòu)建當(dāng)中，主要取得了以下進(jìn)展:
　　1.新型抗腫瘤多肽的序列設(shè)計(jì)、優(yōu)化及作用機(jī)制研究。以多肽Maurioporin為模板設(shè)計(jì)并合成了一條抗腫瘤多肽ZXR-1(FKIGGFIKKLWRSKLA)，通過(guò)將賴氨酸有目的地突變?yōu)楸彼?，得到了親疏水面界限更加分明的多肽ZXR-2（FKI

6、GGFIKKLWRSKLA），MTT結(jié)果顯示突變后多肽整體抗腫瘤活性明顯增強(qiáng);通過(guò)激光共聚焦觀察、Western Blot、流式細(xì)胞儀分析等手段對(duì)多肽的細(xì)胞作用機(jī)制進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)兩條序列上高度相似的多肽在突變前后，細(xì)胞作用機(jī)制發(fā)生明顯變化: ZXR-1能夠進(jìn)入細(xì)胞，破壞線粒體電位，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而ZXR-2則直接作用于細(xì)胞膜，裂解細(xì)胞。我們分析，二者的作用機(jī)制差異一方面來(lái)源于兩親性和電荷分布的區(qū)別，另一方面，多肽序列中“異亮氨酸-亮

7、氨酸”對(duì)（I3-L10，I7-L14）也對(duì)多肽的抗腫瘤活性和作用機(jī)制產(chǎn)生了一定影響。這一氨基酸對(duì)的發(fā)現(xiàn)以及它對(duì)抗腫瘤多肽在活性和作用機(jī)制上的影響在前人的研究中鮮有報(bào)道，對(duì)ZXR-1和ZXR-2的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的分析能夠?yàn)楹罄m(xù)新型抗腫瘤多肽和多肽相關(guān)藥物的設(shè)計(jì)及優(yōu)化提供有益指導(dǎo)。
　　2.抗腫瘤多肽的自組裝改造與結(jié)構(gòu)功能研究。將多肽自組裝機(jī)制應(yīng)用于抗腫瘤多肽的改造上，通過(guò)在無(wú)自組裝能力的抗腫瘤裂解肽PTP-7(FLGALFKALSKL

8、L)的氮端和碳端分別加入谷氨酸和天冬酰胺，成功構(gòu)建了兩條序列高度相似的自組裝抗腫瘤多肽EN(ENFLGALFKALSKLL)和NE(FLGALFKALSKLLNE)。這一方法在改變多肽兩親模式和二級(jí)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，有效調(diào)控了多肽的自組裝過(guò)程。電鏡結(jié)果顯示，不同的兩親結(jié)構(gòu)模式使二者形成了不同納米結(jié)構(gòu)，EN傾向于形成納米纖維而NE傾向于形成膠束。盡管二者都顯示出了長(zhǎng)效的抗腫瘤活性和穩(wěn)定性，但微觀形態(tài)對(duì)其抗腫瘤活性具有重要影響，它能夠直接控制單分

9、子聚集以及單分子從聚集體上解離的難易程度，進(jìn)而能夠調(diào)控抗腫瘤多肽的生物活性。不同兩親模式的構(gòu)建可以有效控制抗腫瘤多肽藥物的細(xì)胞活性和穩(wěn)定性，這一機(jī)制的引入可被應(yīng)用于多種多肽藥物的設(shè)計(jì)中，提高無(wú)載體多肽藥物的穩(wěn)定性和活性，為后續(xù)抗腫瘤多肽藥物的設(shè)計(jì)和臨床應(yīng)用提供參考。
　　3.利用多肽自組裝性質(zhì)構(gòu)建環(huán)境響應(yīng)性水凝膠材料，拓展多肽自組裝的應(yīng)用方向。以RTX序列(GGXGXDXUX)為模板設(shè)計(jì)合成了一條具有pH和鈣離子雙重響應(yīng)性的多肽兩