鱗頭犬牙南極魚(yú)卵殼蛋白的功能初步研究.pdf

1、南極魚(yú)類(lèi)常年生活在-1.9℃的南大洋中，目前已知魚(yú)體適應(yīng)這種低溫的一個(gè)機(jī)制是進(jìn)化出了抗凍糖蛋白（antifreeze glycoproteins,AFGPs），而南極魚(yú)卵被產(chǎn)在海水中，無(wú)AFGPs的保護(hù)，那么南極魚(yú)卵在這種低溫環(huán)境下是如何存活的呢？卵殼蛋白（zona pellucida,ZP）是一類(lèi)識(shí)別精卵結(jié)合的蛋白，已有研究表明，南極魚(yú)Notothenioids亞目魚(yú)類(lèi)ZP基因發(fā)生了大量擴(kuò)增，可能與南極魚(yú)適應(yīng)極端寒冷水域有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室

2、前期研究發(fā)現(xiàn)，卵殼蛋白ZPC5（zona pellucida c5,ZPC5）在南極魚(yú)卵巢中大量表達(dá)，但是其具體功能尚不清楚。實(shí)驗(yàn)室前期研究從鱗頭犬牙南極魚(yú)的卵巢中克隆得到了三種DmZPC5基因（Dissostichus mawsonizona pellucida c5,DmZPC5），分別命名為DmZPC5_1(zona pellucida protein ZPC5 isoform1)、DmZPC5_2(zona pellucida

3、protein ZPC5 isoform2)、DmZPC5_3(zona pellucida protein ZPC5 isoform3)，且編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度逐漸縮短。為了明確DmZPC5是否參與魚(yú)類(lèi)抗凍過(guò)程及其低溫下分子調(diào)控機(jī)制，本研究在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary,CHO）中過(guò)表達(dá)DmZPC5，隨之給予CHO細(xì)胞一定程度的低溫處理，通過(guò)統(tǒng)計(jì)CHO細(xì)胞的存活率，來(lái)探討DmZPC5在魚(yú)類(lèi)抗凍過(guò)程中的作用。

4、本研究結(jié)果表明，DmZPC5有可能參與南極魚(yú)魚(yú)卵抗凍過(guò)程。具體結(jié)果如下：
　　1)將從實(shí)驗(yàn)室獲得的DmZPC5重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果表明，三種DmZPC5基因編碼區(qū)全長(zhǎng)分別為1629bp、1482bp、1389bp，其所編碼的氨基酸數(shù)目分別為543、494、463。
　　2)重組質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果顯示，DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3基因重組質(zhì)粒載體經(jīng)雙酶切電泳后，均有兩條對(duì)應(yīng)的電泳條帶，表明目的

5、基因均正確插入到pIRES2-EGFP載體上。
　　3) Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，目的蛋白DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3均能在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)，0℃低溫處理后，CHO細(xì)胞內(nèi)的DmZPC5的蛋白表達(dá)量明顯高于37℃培養(yǎng)，表明了低溫下DmZPC5的穩(wěn)定性與溫度相關(guān)，即外源蛋白DmZPC5在低溫下更穩(wěn)定。
　　4)存活率檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)DmZPC5的CHO細(xì)胞在0℃處理16 h后，其存活

6、率較對(duì)照組顯著上升（P＜0.001），-2℃處理4h、8h后，存活率也均較對(duì)照組顯著上升（P＜0.01），證明DmZPC5在低溫下可以促進(jìn)細(xì)胞的存活。并且DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3對(duì)CHO細(xì)胞的存活率影響各不相同，瞬時(shí)表達(dá)DmZPC5_1蛋白的CHO細(xì)胞存活率最低，瞬時(shí)表達(dá)DmZPC5_3蛋白的CHO細(xì)胞存活率最高。
　　5)對(duì)低溫處理的CHO細(xì)胞進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果表明，外源性蛋白DmZP

7、C5_1在0℃低溫處理后，蛋白聚合體明顯上調(diào)，而DmZPC5_2、DmZPC5_3均無(wú)蛋白聚合體的產(chǎn)生，僅有蛋白單體量明顯上調(diào)，這可能與其在低溫下對(duì)CHO細(xì)胞的存活率差異有關(guān)。
　　總而言之，本研究通過(guò)對(duì)瞬轉(zhuǎn)DmZPC5的CHO細(xì)胞進(jìn)行低溫脅迫處理，探討了CHO細(xì)胞內(nèi)DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3的蛋白表達(dá)量變化以及CHO細(xì)胞在低溫下存活率。第一方面，低溫下，CHO細(xì)胞中DmZPC5蛋白表達(dá)量較37℃高，有可