鹵蟲休眠卵殼形成的分子機(jī)制及其抗逆功能的研究.pdf

1、鹵蟲(豐年蝦)是一種常見于高原鹽湖、海濱鹽場(chǎng)等高鹽環(huán)境的小型甲殼類動(dòng)物。由于其特殊的生殖方式和驚人的抗逆能力目前已成為逆境生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。也正是因?yàn)檫@種特殊的生存方式，才讓這個(gè)弱小的物種在超過4億年的演變進(jìn)化進(jìn)程中延續(xù)下來。
　　 鹵蟲有卵胎生(ovoviviparity)和卵生(oviparity)兩種迥異的生殖途徑，既可直接產(chǎn)下幼蟲，也可產(chǎn)下包被著堅(jiān)硬外殼的休眠卵。當(dāng)生存環(huán)境條件惡化時(shí)，鹵蟲采用卵生的方式產(chǎn)下后代以延續(xù)

2、自己的種群。這種休眠卵可以忍受長期干旱、缺氧、炎熱、冷凍、高鹽脫水、紫外輻射等極端環(huán)境的考驗(yàn)，以度過漫長的旱季和冬季；一旦環(huán)境條件合適，可以很快從休H民狀態(tài)中復(fù)蘇，繼續(xù)發(fā)育成幼蟲。之前的研究表明，鹵蟲卵的抗逆能力很大程度上來源于其非細(xì)胞的外殼，而該外殼的具體成分和形成機(jī)制目前尚不清楚。
　　 首先，我們通過抑制性消減雜交的方法，從cDNA消減文庫中篩選到一個(gè)與鹵蟲卵殼形成密切相關(guān)的基因，命名為泌殼腺特異性表達(dá)基因(ShellGl

3、and-specifically Expressed Gene，SGEG)，并通過cDNA末端快速克隆(RACE)的方法獲得了該基因的全序列。SGEG基因cDNA長450bp，具有345bp的開放閱讀框(ORF)，其翻譯的多肽經(jīng)預(yù)測(cè)由33個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和81個(gè)氨基酸殘基的成熟肽組成。在DDBJ/EMBL/GenBank等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行各種Blast比對(duì)，沒有發(fā)現(xiàn)任何同源的核酸和蛋白序列。
　　 第二，我們對(duì)SGEG基因的表達(dá)

4、特征進(jìn)行了檢測(cè)分析。Northern blotting結(jié)果顯示該基因僅表達(dá)于卵生途徑的鹵蟲卵囊中，在卵細(xì)胞從卵巢中排出進(jìn)入側(cè)囊時(shí)進(jìn)入表達(dá)高峰期，隨后逐漸下降，并在下一個(gè)生殖周期卵巢排卵時(shí)再次達(dá)到高峰，呈現(xiàn)有規(guī)律的周期性變化。原位雜交結(jié)果精確地顯示了該基因僅在泌殼腺細(xì)胞中特異性表達(dá)。
　　 第三，為了研究SGEG基因的功能，我們采用RNA干涉的方法敲除了該基因，并同時(shí)從核酸和蛋白兩個(gè)方面檢測(cè)了干涉效率。SGEG基因沉默的鹵蟲成蟲沒

5、有出現(xiàn)異常，但其產(chǎn)下的休眠卵發(fā)生了巨大的變化。干涉后產(chǎn)下的卵全部沉在培養(yǎng)箱底部，外殼變得柔軟且具有弱粘性。通過解剖鏡和倒置顯微鏡觀察，干涉卵的卵殼呈現(xiàn)透明的淡黃色而不是正常的褐色，可以清晰看見內(nèi)部的胚胎。掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的結(jié)果顯示，干涉卵的卵殼表面變得粗糙且呈現(xiàn)出片層狀，整個(gè)殼層變得疏松，電子透射率大幅上升。另外，卵殼皮質(zhì)層的厚度減小，其內(nèi)部的莢孔也變得模糊而紊亂。我們同時(shí)檢測(cè)了干涉卵中常見金屬元素的變化，結(jié)果顯示鐵元素的

6、含量減少非常顯著，同時(shí)鉀元素含量顯著上升。伴隨著卵殼的變化，干涉卵在生理上也出現(xiàn)了異常，主要表現(xiàn)為不需要活化過程就可以直接孵化，具有超過20％的孵化率。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在SGEG基因被敲除后，干涉卵總蛋白發(fā)生了明顯的變化。根據(jù)蛋白條帶的分子量，我們認(rèn)為其中卵黃蛋白、artemin和p26明顯減少，而p49等蛋白顯著上升。根據(jù)這些結(jié)果我們推測(cè)干涉卵的休眠狀態(tài)并不徹底，在合適的環(huán)境中相對(duì)容易打破休眠而恢復(fù)發(fā)育。
　　 最后