南極絲瓜蘚耐逆相關功能基因的發(fā)掘和功能研究.pdf

1、南極陸地生態(tài)系統(tǒng)是寒冷、干燥和低營養(yǎng)環(huán)境，并伴隨著急劇的溫度變化和極少的可利用水資源。由于嚴酷的氣候條件，植物主要生長在南極大陸海岸線邊緣無冰雪覆蓋的陸地表層，通常是一小塊孤立的地方。隱花植物（苔蘚和地衣）是南極大陸最主要的植物類型，這些南極植物為發(fā)現(xiàn)新的功能基因和揭示極端環(huán)境適應機制以及生物進化提供了良好的材料。但是，到目前為止，對于南極苔蘚適應極端環(huán)境條件的生存機制仍然不清楚。本研究中，我們利用Illumina公司的高通量測序技術分

2、析了南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）在低溫、高鹽脅迫下的轉錄組，從基因組水平上分析了一些重要抗逆基因的表達特征。此外，我們分析了類黃酮羥化酶和JAZ蛋白在南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）適應極端環(huán)境中的作用。本研究對于揭示南極苔蘚適應極端環(huán)境機理，促進極地特殊基因資源的開發(fā)和利用具有一定的理論意義和應用價值。
　　1、利用第二代轉錄組測序技術分析南極絲瓜蘚的抗逆相關功能基因
　　從基因組水平上研究南極絲瓜蘚（

3、Pohlia nutans）的功能基因在寒冷脅迫條件下的響應特征，對于發(fā)掘抗逆相關基因及其在適應極地極端環(huán)境中的作用十分重要。本研究在國內(nèi)外率先利用第二代高通量測序技術分析了南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）在正常條件下、低溫脅迫(4℃，6h)下和高鹽脅迫下(200mM NaCl，1h)的基因表達譜特征。轉錄組測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)已經(jīng)提交國際Short Read Archive(SRA)數(shù)據(jù)庫，公開注冊號為SRA051595;轉錄組測序

4、拼接之后的數(shù)據(jù)提交到DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫，公開注冊號為GACA00000000。轉錄組測序后最終共得到93488的單一基因序列，平均長度為405個堿基;單一基因序列大于500個堿基的共有18688個?；蚬δ茏⑨尠l(fā)現(xiàn)有16782個序列編碼已知功能蛋白;它們中多數(shù)都可以通過GO、KOG和KEGG數(shù)據(jù)庫進行聚類分析和代謝通路分析?；蚪M水平上的基因差異表達分析表明，在寒冷脅迫條件下有3796個轉錄本的表達水平顯著上調(diào)，有

5、1405個轉錄本的表達水平顯著下調(diào)。在鹽脅迫條件下有820個轉錄本的表達水平顯著上調(diào)，有350個轉錄本的表達水平顯著下調(diào)。并且，我們從南極絲瓜蘚轉錄組中共鑒定得到了816類受體蛋白激酶（receptor-like kinases）基因和1309轉錄因子。對轉錄組的基因差異表達分析發(fā)現(xiàn)類受體蛋白激酶、轉錄因子和次生代謝關鍵酶等可能在南極苔蘚抗逆機制中發(fā)揮重要作用。本文從基因組水平上分析了一些重要抗逆基因的表達特征，對于揭示南極苔蘚抗極端環(huán)

6、境的機制和極地基因資源的開發(fā)具有重要作用。
　　2、JAZ蛋白在南極絲瓜蘚適應極端環(huán)境中的作用及相關的分子機制研究
　　高鹽脅迫是限制許多農(nóng)作物生長的關鍵因素。茉莉酸和脫落酸在植物調(diào)節(jié)鹽脅迫的抗性過程中發(fā)揮重要作用。之前的研究表明JAZ(jasmonate ZIM-domain)轉錄抑制因子是茉莉酸信號途徑的關鍵調(diào)節(jié)蛋白。茉莉酸誘導JAZ蛋白與SCFCOIl泛素連接酶結合，導致JAZ蛋白通過26S蛋白酶體途徑被降解。但是，J

7、AZ蛋白在茉莉酸介導的植物對鹽脅迫抗性過程中發(fā)揮的作用仍然不清楚。
　　本研究中，我們從南極絲瓜蘚（Pohlia nutans）中克隆得到一個JAZ（簡稱PnJAZ9，以下相同）基因，并對該基因的功能進行了較為深入的分析?；虮磉_水平分析表明，PnJAZ9基因在低溫(4℃)、高鹽(200 mM NaCl)、聚乙二醇(20％ PEG6000)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)脅迫條件下表達水平顯著上調(diào);蛋白序列比對分析表明PnJAZ

8、9具有典型JAZ家族蛋白的ZIM和Jas結構域。與擬南芥基因組中的17個JAZ轉錄因子一起構建系統(tǒng)進化樹，表明南極絲瓜蘚PnJAZ9基因與擬南芥AtJAZ9(TIFY7)的親緣關系最近。通過構建“PnJAZ9-綠色熒光蛋白(GFP)”的瞬時表達載體，利用聚乙二醇(PEG4000)介導轉化擬南芥原生質體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察PnJAZ9蛋白的亞細胞定位情況，發(fā)現(xiàn)該基因的表達產(chǎn)物主要定位于細胞核中，僅有少量在細胞質中表達。
　　構

9、建了PnJAZ9的過量表達載體，利用農(nóng)桿菌侵染擬南芥，篩選和繁種，最終獲得過量表達的轉基因純合植株。JAZ蛋白是茉莉酸途徑的負調(diào)控因子。研究表明，過表達PnJAZ9抑制了茉莉酸信號途徑。在100μM MeJA處理條件下，擬南芥PnJAZ9過表達株系的萌發(fā)率顯著高于野生型植株。實時定量PCR證實擬南芥過表達株系中茉莉酸信號途徑關鍵轉錄因子MYC2和VSP1的表達水平顯著低于野生型植株。利用酵母雙雜交證實全長PnJAZ9或者JAZ9(039

10、18)△ N△C蛋白都能夠與擬南芥AtMYC2、AtMYC3、AtMYC4轉錄因子相互作用。
　　過表達南極絲瓜蘚PnJAZ9增強了轉基因植株在種子的萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育階段對高鹽脅迫的抗性。在100 mM NaCl處理條件下培養(yǎng)6天時，野生型植株的種子幾乎沒有萌發(fā)，而過表達系AtOE1、AtOE2和AtOE3的種子萌發(fā)率分別為47.06％、44.71％和56.47％。同時，過表達南極絲瓜蘚PnJAZ9也增強了轉基因植株對滲透脅迫的

11、抗性;在0.2M或者0.3M甘露醇脅迫條件下，過表達系(AtOE)的種子萌發(fā)率顯著高于野生型植株種子的萌發(fā)率（處理6天后的種子）。
　　在種子萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育階段，過表達PnJAZ9提高了植株對ABA脅迫的抗性。在0.25μM ABA處理條件下，過表達系AtOE1、AtOE2和AtOE3的種子萌發(fā)率分別是94.87％、84.64％和92.31％（處理6天的種子萌發(fā)率），然而野生型植株種子萌發(fā)率僅為25.64％。同時，我們發(fā)現(xiàn)過表

12、達植株對葡萄糖和生長素(IAA)產(chǎn)生明顯抗性，表現(xiàn)出與擬南芥ABI4或ABI5（ABA途徑中的關鍵轉錄因子）等突變體相似的表型。由此推測，在轉基因植株中，過表達PnJAZ9可能抑制了ABA信號途徑中的某些關鍵的正調(diào)控因子例如ABI4和ABI5。進而，我們利用實時定量PCR(RT-qPCR)技術檢測了ABA途徑中與種子萌發(fā)相關的基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)過表達植株ABA途徑中關鍵調(diào)節(jié)基因ABI4、ABI5、RD22a、RD29a和MYB2等都呈

13、顯著的下調(diào)表達模式。
　　綜上所述，我們推測南極絲瓜蘚PnJAZ9蛋白可能通過與ABA信號途徑中的正調(diào)控因子相互作用，參與調(diào)解植物在高鹽脅迫條件下茉莉酸和脫落酸兩個信號途徑之間復雜的相互作用過程。
　　3、南極絲瓜蘚類黃酮羥化酶的系統(tǒng)進化和非生物脅迫下表達模式分析
　　類黃酮是一類廣泛存在的植物次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物學功能，包括植物的防御反應、抗紫外輻射、生長素轉運的抑制、植物化感作用、花器官成色等。黃酮類化合物在

14、植物從水生轉移到陸地環(huán)境的早期演化過程中發(fā)揮重要作用。在類黃酮的合成過程中，類黃酮的羥基化修飾作用對于其顯色、穩(wěn)定性和抗氧化能力的功能至關重要。類黃酮-3'-羥化酶(F3'Hs)和類黃酮-3'，5'-羥化酶(F3'，5'Hs)屬于細胞色素P450蛋白家族，它們分別催化類黃酮B環(huán)3'或3'，5'位置的羥基化反應。但是，到目前為止在較低等的植物（例如，苔和蘚）中類黃酮羥化酶的作用仍然沒有報道。本研究中，通過逆轉錄PCR(RT-PCR)和RA

15、CE擴增技術，從南極絲瓜蘚中共克隆得到了16條類黃酮3'羥基化酶(F3'H)和類黃酮3'，5'羥基化酶(F3'，5'H)基因的全長序列。蛋白序列比對分析發(fā)現(xiàn)，它們都具有典型的類黃酮羥化酶的結構域，即包括富含脯氨酸的“鉸鏈”結構域、EXXR基序、結合氧分子的“口袋”基序和亞鐵血紅素結合結構域及底物識別位點。之前對類黃酮羥化酶基因的研究報道均指出，來自同一祖先的類黃酮-3'-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶是在裸子植物和被子植物發(fā)生進化分

16、離時開始獨立進化的。本研究中，通過系統(tǒng)進化分析我們發(fā)現(xiàn)，南極絲瓜蘚和小立碗蘚中類黃酮-3'-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶這兩個家族的蛋白都是完全分開的，即類黃酮-3'-羥化酶或者類黃酮-3'，5'-羥化酶分別地聚類在一起。因此，我們確認類黃酮-3'-羥化酶和類黃酮-3'，5'-羥化酶在進化上的分離從苔蘚類植物開始就已經(jīng)發(fā)生了。類黃酮羥化酶基因的差異表達、類黃酮羥化酶在細胞中的比例（即F3'H∶ F3'，5'H）將直接影響類黃酮化合

17、物的種類和分布，最終可能影響植物在逆境脅迫條件下的生存能力。本研究中，我們利用RT-qPCR技術分析發(fā)現(xiàn)，低溫、高鹽、干旱、紫外輻射、植物激素脫落酸和茉莉酸等都能夠影響南極絲瓜蘚中類黃酮羥化酶基因的表達水平。過表達類黃酮-3'-羥化酶(MFC00060)使植株在種子萌發(fā)和幼苗早期發(fā)育階段對NaCl和ABA的抗性降低，但是提高了過表達系植株對過氧化氫脅迫的抗性。黃酮類化合物作為一種活性氧清除劑，其含量體現(xiàn)了不同植物在生化方面對氧化脅迫的抗