雙光子熒光顯微鏡用于在體小鼠下丘腦腹內側核神經細胞內Ca2+檢測的方法學探討.pdf

1、背景：
　　雙光子熒光顯微鏡成像技術已經被視為一項重要的科學研究技術來探測細胞內的鈣信號和細胞膜電位變化等。隨著技術改進，近幾年這種技術也可以對一些麻醉狀態(tài)下的動物進行在體檢測。但是，傳統(tǒng)的雙光子熒光顯微鏡的在體熒光成像技術局限在大腦顱頂皮層的細胞，不能直接觀測到大腦深層細胞和顱底表層。下丘腦腹內側核（ventromedial hypothalamic nucleus，VMH），由于位于顱底淺層，按照以往的實驗方式利用雙光子熒光顯

2、微鏡不可能在體檢測到VMH的熒光信號。
　　目的：
　　通過顱底暴露手術聯合雙光子熒光成像技術實現在體記錄VMH區(qū)域神經元鈣離子活動信號并研究下丘腦核團活動規(guī)律。
　　方法：
　　1.加頭件
　　將麻醉小鼠顱頂正中消毒脫毛去皮后黏上鈦合金頭件，并涂上厚厚的牙科水泥將周圍縫隙填滿，以便拍攝時牢牢固定小鼠。
　　2．監(jiān)測小鼠主要生理指標
　　手術過程中用小鼠無創(chuàng)血氧儀全程監(jiān)測小鼠各項生理指標。其中通

3、過直腸探針監(jiān)測體溫，通過紅外傳感器檢測心率和血氧飽和度。將小鼠放在加熱墊上并將加熱墊溫度維持在約36°C。
　　3.氣管插管
　　將小鼠仰臥位固定在加熱墊上。在脖子中線做一個1厘米的切口暴露下頜腺體。然后用止血鉗鈍性分離肌肉直到暴露氣管，將一個3厘米的橡膠管插入氣管并用無菌手術線打結。
　　4.顱底暴露手術
　　將彎頭止血鉗尖端緊貼在下頜肌肉上，再將高頻電刀尖端垂直放在血管鉗尖端，從上至下緩慢勻速用雙極電凝燒灼表

4、面血管。用外科手術剪將兩顆門牙中間剪開一個小口，再用高頻電刀電切分開小鼠兩顆門牙。
　　用高頻電刀從上往下電切開下頜肌肉，再用舌頭環(huán)切術去掉小鼠舌頭。用電刀電切小鼠上顎表面，然后用高速顱骨鉆把腔隙磨大（約2.5mm x5.0mm）再把周邊的骨頭磨薄至半透明狀態(tài)，用鑷子小心地從邊緣掀開硬腦膜，去除掉腔隙全部骨頭和硬腦膜。
　　5.注射鈣指示劑
　　通過熒光標記法給小鼠下丘腦腹內側核區(qū)域注射鈣離子指示劑OGB-1，來追蹤鈣

5、瞬態(tài)變化。注射完后貼上玻片并用1.5%的低熔點瓊脂糖壓住以減小小鼠的肌肉抖動和呼吸振動對拍攝平面的影響。
　　6.雙光子熒光顯微鏡下在體成像
　　將注射過鈣指示劑OGB-1的小鼠固定到雙光子實驗臺上，用雙光子顯微鏡下掃描VMH區(qū)域，成像深度約為-300~-550μm，拍攝速度為20.4幀／秒（像素為768x768像素）。
　　結果：
　　1.成功建立一套小鼠顱底暴露下丘腦核團手術。術后成活小鼠的生理指標包括體溫、

6、血氧飽和度、心率具有普遍特征，均呈隨手術時間推移緩慢波動回升。
　　2.下丘腦腹內側核區(qū)域自發(fā)鈣活動并不一致，在被檢測的時間內有的呈高頻活動，有的低頻活動，即使同一個神經元，其活動間隔時間也不相等，自發(fā)鈣活動頻率范圍在0.004Hz~0.0204Hz。
　　3.膠質細胞聚集在一起并與血管和神經元形成一個密集的網絡，而與它相連的其他神經元活動時也能同時誘導膠質細胞內鈣離子濃度的升高，說明了膠質細胞也具有與神經元類似的特性，可能