細胞內多種活性小分子(GSH、Cys、Hcy,NO、Ca2+)同時定量檢測的新方法研究.pdf

1、細胞是生物體形態(tài)結構和生命活動的基本單位，是生命科學研究的根本出發(fā)點。細胞內源性小分子，如小分子硫醇（GSH、Cys、Hcy）、一氧化氮（NO）、鈣離子（Ca2+）等，是生命活動過程中重要的活性小分子。這些活性小分子不僅參與細胞活化、調控等重要的生理過程，而且與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關。
　　其中，GSH不僅維持著生物體的氧化還原平衡，而且參與細胞凋亡等過程的信號傳導，同時能夠解除外源化合物的毒性; Cys和Hcy的生理濃度水平也

2、是重要的健康指標，Cys缺乏與兒童生長緩慢、造血功能減弱、嗜睡和肝臟損傷等病癥相關，而 Hcy濃度升高則是心血管疾病、動脈粥樣硬化、老年癡呆癥等疾病的風險因子。NO作為重要的信號分子，在神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、及免疫系統(tǒng)中具有重要的調節(jié)作用，且NO含量異常與心血管疾病（高血壓、冠心病、心肌梗死、心絞痛等）、糖尿病、癌癥等疾病相關。Ca2+作為重要的第二信使，幾乎參與所有的生理調控，而且一些疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴隨著細胞內Ca2+分布和濃度的

3、大幅度變化。
　　另一方面，活性小分子在細胞中不僅共存，而且反應活性高、彼此相關、相互協(xié)同，相應檢測技術應具備高靈敏度、高選擇性以及有效分離性能。為揭示它們在細胞功能調控中的作用以及與疾病關聯(lián)，必須了解細胞內該類物質的定量信息、以及它們之間相互作用的真實信息，因此迫切需要發(fā)展高靈敏、多參數(shù)、可同時定量測定細胞內多種活性小分子（GSH、Cys、Hcy，NO、Ca2+）的新方法。本論文主要包括以下兩個部分：
　　第一章，鑒于細胞

4、內小分子生物硫醇（GSH、Cys、Hcy）在細胞的氧化還原平衡、癌癥的發(fā)生發(fā)展中的重要作用及三者之間的密切關聯(lián)，發(fā)展了一種基于同位素質譜探針的同時定量檢測正常肝細胞和肝癌細胞內GSH、Cys、Hcy三種小分子生物硫醇的LC/ESI-MS新方法。首先設計合成了N-苯硒基鄰苯二甲酰亞胺-d5（NPSP-d5）同位素探針，并與NPSP-d0組成同位素探針對；然后驗證了（NPSP）同位素探針與生物硫醇的反應機理，表征了其對生物硫醇的相對定量性，

5、證明了其避免生物硫醇氧化的有效性；最后利用NPSP同位素探針對對不同生物樣品內的生物硫醇分別進行衍生化標記，并在混合后進行一系列的樣品處理，最終通過已優(yōu)化的LC/ESI-MS方法實現(xiàn)對不同樣品中多種小分子生物硫醇同時相對定量分析。
　　第二章，鑒于NO與Ca2+均為細胞內重要的信使分子，且二者之間有著密切的關聯(lián)。本章建立了一種對單細胞內NO和Ca2+同時定量檢測的微流控芯片電泳-激光誘導熒光（MCE-LIF）分析法。采用熒光探針3

6、-氨基-4-氨甲基-2’,7’-二熒光素乙酸鹽（DAF-FM DA）和1-[2-氨基-5-(2,7-二氯-6-羥基-3-氧-9-夾氧蒽基)苯氧基]-2-(2-氨基-5苯氧甲基)乙烷-N,N,N,’N,’-四乙酸，季四戊醇乙酰氧基甲基酯（Fluo-3 AM）分別對NO、Ca2+進行熒光標記。利用MCE-LIF，在優(yōu)化的實驗條件下，實現(xiàn)了單細胞（4T1）內NO和Ca2+的同時定量檢測，該方法為后續(xù)研究不同生理過程及生理狀態(tài)下NO與Ca2+的