姜黃素脅迫下朱砂葉螨mRNA測序及響應(yīng)基因分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室通過篩選一系列化合物發(fā)現(xiàn)，源于中草藥植物姜黃的活性物質(zhì)姜黃素對朱砂葉螨表現(xiàn)出良好的殺螨活性，具有開發(fā)成綠色殺螨劑的潛力。因此明確姜黃素殺螨的分子機(jī)制，從而以姜黃素的作用靶標(biāo)為依據(jù)，以姜黃素為模板，進(jìn)行分子優(yōu)化，將有助于新的綠色殺螨劑的研制。目前雖然在姜黃素的殺螨機(jī)理方面取得了一定的進(jìn)展，但是殺螨的分子機(jī)制仍不清楚。并且，朱砂葉螨基因信息以及姜黃素殺螨機(jī)制密切相關(guān)的應(yīng)答基因的缺乏一直是該領(lǐng)域的一大阻礙。本研究采用了數(shù)字基因表達(dá)譜升

2、級版測序技術(shù)對朱砂葉螨響應(yīng)姜黃素脅迫的分子機(jī)制以及響應(yīng)基因進(jìn)行了研究，擴(kuò)展了參與姜黃素殺螨的基因信息資源，為進(jìn)一步全面闡述姜黃素的殺螨機(jī)理提供了思路，同時豐富了天然活性物質(zhì)殺蟲/螨機(jī)制的研究內(nèi)容。主要的研究成果如下：
　　1.明確了姜黃素對朱砂葉螨的LC50為2.642mg/mL，并表現(xiàn)出類似神經(jīng)毒劑的中毒癥狀姜黃素的生物活性測定結(jié)果表明，姜黃素對朱砂葉螨48 h的毒力回歸方程為y=-0.278+0.659x，致死中濃度LC50為

3、2.642 mg/mL，95％的置信區(qū)間為1.680~6.082。玻片浸漬法和葉碟噴霧法處理朱砂葉螨后進(jìn)行癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，朱砂葉螨的中毒癥狀大致可分為：靜止期（0 h-4 h）；復(fù)蘇興奮期（4 h-48 h）；麻痹昏迷期（48 h-72 h）；死亡期（72 h-144 h）。這跟神經(jīng)毒劑的致毒癥狀有一定的相似性。并根據(jù)中毒癥狀明確了姜黃素作用的重要時間節(jié)點(diǎn)24 h和48 h，為下步測序?qū)嶒?yàn)提供理論依據(jù)。
　　2.獲得并驗(yàn)證了數(shù)字基因

4、表達(dá)譜測序結(jié)果，明確了姜黃素處理下朱砂葉螨響應(yīng)基因參與的主要生物學(xué)過程處理組和溶劑對照組測序分別得到53419438條和52286859條Reads。24 h和48 h的差異表達(dá)基因分別為15450條和15371條。滿足偏離概率值≥0.8并且log2Ratio≥1的顯著差異基因分別有111條和96條。此外，熒光定量證實(shí)了mRNA測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時說明參與驗(yàn)證的15條基因也確實(shí)對姜黃素發(fā)生了響應(yīng)。GO功能顯著性富集分析明確了顯著差異基

5、因參與的主要生物學(xué)過程包括生理過程、代謝過程、單生物過程、細(xì)胞凋亡、連接和催化、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)傳導(dǎo)等。KEGG通路富集分析羅列了富集程度排名前20的生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是24 h和48 h均具有的最具代表性的生化途徑。另外與化合物分解代謝、信號傳導(dǎo)、細(xì)胞吞噬等作用有關(guān)的基因約占整個KEGG通路基因的64%。這些GO條目和KEGG條目里所包含的基因很可能與姜黃素殺螨機(jī)制密切相關(guān)。

6、>　　3.獲得23條與螨體代謝、信號傳導(dǎo)等相關(guān)的顯著差異基因，測定了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性，明確了螨體解毒代謝情況通過RPKM和Noiseq算法，篩選出兩處理時間段的顯著差異基因總條數(shù)為190條，共有基因?yàn)?7條。獲得了醫(yī)學(xué)上姜黃素的靶標(biāo)絲氨酸/蘇氨酸激酶以及與姜黃素的醫(yī)學(xué)靶標(biāo)相關(guān)的鳥苷酸激酶、硫氧還蛋白樣4A和RasGTP酶。另外本研究還獲得了很多與鈣離子相關(guān)的酶，如磷脂酶C家族、磷脂酶A2、鈣調(diào)蛋白、鈣聯(lián)接蛋白和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白

7、1，其中磷脂酶A2和鈣調(diào)蛋白是重要的信號傳導(dǎo)類蛋白也是差異表達(dá)最明顯的基因，可以作為姜黃素殺螨作用的候選靶標(biāo)。同時獲得了GSTs基因，明確了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶隨姜黃素處理時間的變化情況，初步說明朱砂葉螨體內(nèi)姜黃素的減少并非是與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶發(fā)生作用所致。
　　4.克隆并分析了朱砂葉螨鈣調(diào)蛋白(calmodulin,TcCaM)和磷脂酶A2(phospholipase A2,TcPLA2)基因的cDNA序列克隆獲得了TcCaM和

8、TcPLA2基因cDNA序列，分別命名為TcCaM、TcPLA2，登錄號分別為：KY436226、KY436225。預(yù)測蛋白質(zhì)相對分子量分別為19.03KDa和12.04KDa，等電點(diǎn)分別為4.32和4.97。另外通過信號肽、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)、糖基化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)蛋白和磷脂酶A2均無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，均為非跨膜蛋白。鈣調(diào)蛋白具有四個EF-hand結(jié)構(gòu)域和兩個糖基化位點(diǎn)，磷脂酶A2只有一個糖基化位點(diǎn)，未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹結(jié)果顯示這

9、兩條基因所處的分支分別與二斑葉螨最接近，該結(jié)果與傳統(tǒng)意義上的分類結(jié)果一致。
　　5.朱砂葉螨TcCaM和TcPLA2基因在不同螨態(tài)均有表達(dá)，對姜黃素殺螨機(jī)制的研究具有重要價值 TcCaM和TcPLA2基因在朱砂葉螨不同螨態(tài)的表達(dá)表明：這兩個基因在朱砂葉螨的四個螨態(tài)中均有表達(dá)，并且幼螨、若螨期的表達(dá)量要顯著高于卵期和成螨期。鈣調(diào)蛋白基因的表達(dá)由高到低依次為若螨>幼螨>成螨>卵，除幼螨、若螨差異不顯著外，其余均呈顯著性差異。磷脂酶A2