朱砂葉螨酯酶基因克隆及其mRNA表達研究.pdf

1、朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)在我國分布廣泛，是嚴重為害棉花、蔬菜等多種作物而又難于防治的一種害螨。該螨繁殖能力強，產(chǎn)卵力高，世代周期短，在短時間里能夠迅速形成一定數(shù)量的種群，并且容易產(chǎn)生抗藥性。 酯酶是指能夠水解羧酸酯鍵和磷酸酯鍵的酶的通稱，屬于絲氨酸水解酶家族，是代謝多種殺蟲劑的一大類酶，其作用在于優(yōu)先水解水溶性短鏈酯類的酯鍵。在國外對酯酶基因的克隆研究很活躍，而國內(nèi)這方面的研究起步較晚。

2、 本項研究通過RACE技術(shù)克隆朱砂葉螨敏感品系的酯酶基因TCE1和TCE2的cDNA全長，并用real-time FO-PCR技術(shù)分別檢測了克隆的酯酶基因TCE1和TCE2的mRNA分別在朱砂葉螨不同發(fā)育時期(卵、幼螨、若螨和成螨)、不同品系(阿維菌素、甲氰菊酯、氧化樂果抗性品系和朱砂葉螨敏感品系)以及阿維菌素誘導前后的表達差異，從基因水平初步探討朱砂葉螨酯酶基因的表達變化與其抗藥性形成之間的內(nèi)在聯(lián)系。本研究得到了國家自然科學基金(3

3、0571239)的資助，獲得以下主要研究結(jié)果。 一、朱砂葉螨酯酶基因的克隆根據(jù)已克隆得到的朱砂葉螨酯酶基因片段設(shè)計特異性引物，采用cDNA末端快速擴增技術(shù)(RACE)，成功地從朱砂葉螨敏感品系中克隆到了兩條具有完整開放閱讀框的酯酶基因的cDNA全序列，分別暫命名為TCE1和TCE2。其中TCE1的ORF為1704 bp，5’端非編碼區(qū)為25 bp，3’端非編碼區(qū)為64 bp和polyA尾。由cDNhL序列推導出來的序列全長為56

4、7個氨基酸，其中包括了由20個氨基酸組成的信號肽。該基因編碼的氨基酸序列理論分子量為62.75kDa，等電點(pI)為6.41，第1757處有AATAAA加尾信號。TCE2的ORF為1683 bp，5’端非編碼區(qū)為96 bp，3’端非編碼區(qū)為244 bp和polyA尾。由cDNA序列推導出來的序列全長為560個氨基酸，其中包括了由23個氨基酸組成的信號肽。該基因編碼的氨基酸序列理論分子量為63.14kDa，等電點(pI)為5.70，第1

5、990bp處有AATAAA加尾信號。 二、朱砂葉螨酯酶基因的序列分析將朱砂葉螨酯酶TCE1和TCE2兩條基因的氨基酸序列分別提交至NCBI，進行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)(BLASTP)同源比對，發(fā)現(xiàn)克隆獲得的兩條酯酶基因氨基酸序列都同時具有Esterase-lipase和COesterase的保守結(jié)構(gòu)域，且具有完整的N端和C端。其中酯酶TCE1基因氨基酸序列與TCE2基因氨基酸序列的同源性最高，為46％。其次與蜱螨目的微小牛蜱Boophi

6、lus microplus esterase的同源性為34％，與其他動物酯酶的同源性多在32％～33％之間。朱砂葉螨敏感品系酯酶TCE2基因氨基酸序列與TCE1基因氨基酸序列的同源性最高，為46％，其次與褐飛虱Nilaparvata lugens ace precursor的同源性為35％，與其他動物酯酶的同源性類似于TCE1基因，在32％～34％之間。 通過對2條酯酶基因進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)克隆獲得的朱砂葉螨的兩條酯酶基因

7、，具有AChE的多個功能位點：(1)保守的催化三聯(lián)體：(2)六個保守的半胱氨酸殘基形成三對二硫鍵；(3)保守的陰離子洞；(4)GESAG序列。但是TCE1和TCE2與昆蟲AChE基因的同源性較低。利用Scanprosite在線軟件對其進行分析發(fā)現(xiàn)，這兩條朱砂葉螨酯酶基因都具有B型羧酸酯酶的F-[GR]-G-x(4)-[LIVM]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-G(S是活性部位氨基酸殘基)特征結(jié)構(gòu)，TCE1和TCE2基因所

8、對應(yīng)的B型羧酸酯酶保守結(jié)構(gòu)序列分別為FGGnpdqVtIfGeSAG和FGGdpnrVtLfGqSAG。從GenBank數(shù)據(jù)庫中收到部分代表性的昆蟲及蜱螨等酯酶系列的氨基酸序列進行分子進化分析，結(jié)果表明，用于分析的所有酯酶大致可以分成幾個類群：昆蟲ACHE1類群、昆蟲ACHE2類群、線蟲AChE類群、蜱螨酯酶群、昆蟲羧酸酯酶和酯酶群。朱砂葉螨酯酶基因與蜱螨目的微小牛蜱酯酶基因同源性最高且屬于比較原始的一個類群。表明克隆獲得的兩條朱砂葉螨

9、基因應(yīng)屬于酯酶基因。 三、朱砂葉螨酯酶基因的mRNA表達量的測定利用反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(reverse transcriptase polymerasc chain reaction，RT-PCR)的方法對朱砂葉螨β-actin基因cDNA片段進行了克隆，獲得了包含822個堿基對(bp)，編碼273個氨基酸的β-actin基因片段。并根據(jù)此β-actin基因片段序列設(shè)計引物，建立了基于SYBR Green I染料技術(shù)的real

10、-time FQ-PCR方法，為以β-actin基因作為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR方法對朱砂葉螨不同功能基因mKNA表達進行定量研究提供了有用的參考依據(jù)。 在上述研究的基礎(chǔ)上，以朱砂葉螨β-actin基因為內(nèi)參基因，用基于SYBR Green I染料技術(shù)的real-time FO-PCR方法對朱砂葉螨敏感品系的卵、幼螨、若螨、成螨四個螨態(tài)的TCE1和TCE2基因mRNA的相對表達量測定。結(jié)果表明，朱砂葉螨TCE1基因在四個

11、螨態(tài)中的表達量分別為β-actin基因的0.02334、0.02163、0.02057和0.05130倍；TCE2基因在四個螨態(tài)中的表達量分別為β-actin基因的0.0422、0.00636、0.03757和0.23351倍，成螨體內(nèi)的TCE基因的mRNA表達量顯著高于其它各螨態(tài)的mRNA表達量，且TCE2基因在成螨體內(nèi)的mRNA的表達量最高。 對朱砂葉螨抗阿維菌素、抗甲氰菊酯和抗氧化樂果三個抗性品系和敏感品系的TCE1和TC

12、E2基因進行了mRNA的相對表達量測定。結(jié)果表明，朱砂葉螨三個抗性品系的TCE1基因的表達量分別為敏感品系的0.725倍、1.810倍和2.087倍；TCE2基因的表達量分別為敏感品系的0.882倍、1.490倍和1.703倍。朱砂葉螨抗甲氰菊酯、抗氧化樂果品系的TCE1和TCE2的mRNA表達量都顯著高于抗阿維菌素品系和敏感品系；而朱砂葉螨抗阿維菌素品系中兩酯酶基因的表達量與敏感品系之間無顯著性差異，但均表現(xiàn)有降低的趨勢；其中TCE1