雙孢菇漆酶的分離提取及其應(yīng)用.pdf

1、漆酶(EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于植物、細(xì)菌、高等真菌和昆蟲中，在食品工業(yè)、造紙工業(yè)、有機(jī)合成、工業(yè)染料和醫(yī)療等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。漆酶在環(huán)境保護(hù)方面的利用也受到了人們的關(guān)注。
　　本研究從雙孢菇子實(shí)體中提取漆酶，并以2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)為底物研究漆酶的基本酶學(xué)性質(zhì)。雙孢菇子實(shí)體經(jīng)勻漿、過(guò)濾、硫酸銨沉淀、透析和陰離子交換層析，獲得的漆酶比活為56.58U/mg蛋白質(zhì)，回收

2、率為3.9％，純化倍數(shù)為2.8。當(dāng)漆酶以ABTS為底物時(shí)，測(cè)得的酶反應(yīng)最適pH為2.4，最適溫度為65℃。雙孢菇漆酶在30℃和pH2.4條件下穩(wěn)定性較好。0.05mol/L的Cu2+對(duì)漆酶有激活作用，而Fe2+顯著抑制漆酶活性。在最適條件下，雙孢菇漆酶對(duì)ABTS的Km值為2.94mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為0.20mmol/(L·min)。
　　以雙孢菇漆酶為生物催化劑，探討了pH分別對(duì)酶催化兒茶素和對(duì)乙酰氨基酚氧化的影響

3、，并對(duì)比了其催化兒茶素和對(duì)乙酰氨基酚及兩者混合物氧化的效果。在30℃條件下，漆酶對(duì)兒茶素和對(duì)乙酰氨基酚的最適pH分別為3.0和2.2。在30℃，pH3.0條件下，加入1U/mL漆酶，反應(yīng)96h后5mmol/L兒茶素殘留為3％;在同等條件下，用漆酶處理等摩爾濃度的對(duì)乙酰氨基酚，其殘留量為21％。若反應(yīng)體系同時(shí)含有兒茶素和對(duì)乙酰氨基酚，漆酶優(yōu)先催化兒茶素氧化。
　　本研究以納米SiO2顆粒為固定化載體，確定了雙孢菇漆酶的固定化條件和酶

4、負(fù)載量，并研究了固定化漆酶的酶學(xué)性質(zhì)。0.04g納米SiO2顆粒加入4mL無(wú)水乙醇和80μL3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，在30℃反應(yīng)2h后得到表面氨基化的納米SiO2顆粒;以戊二醛為交聯(lián)劑，在氨基化納米SiO2懸浮液中加入雙孢菇漆酶，4℃下過(guò)夜反應(yīng)，得到固定化漆酶。當(dāng)納米SiO2顆粒的負(fù)載量為6U/g時(shí)，固定化收率最高。固定化漆酶的最適pH和最適溫度分別為2.2和65℃。在最適條件下，固定化漆酶對(duì)ABTS的Km為0.88mmol