l-谷氨酸氧化酶的制備及固定化研究.pdf

1、L-谷氨酸氧化酶(EC1.4.3.11 Gox)是以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的一種黃素酶，它能特異的催化立體異構(gòu)的L-谷氨酸氧化脫氨基，生成α-酮戊二酸、H2O2和氨。而纖維素結(jié)合域(CBD)能特異的結(jié)合在纖維素載體上，對(duì)纖維素沒(méi)有催化作用。作為一種大量存在，并具有潛在應(yīng)用的可再生能源，它具有結(jié)合量大、結(jié)合特異性強(qiáng)等特性。通過(guò)融合蛋白表達(dá)，將目的蛋白固定化纖維素基質(zhì)上，從而發(fā)揮融合蛋白的功能及作用。本論文以現(xiàn)有的谷氨酸氧化酶基

2、因進(jìn)行了克隆、異源表達(dá)、純化和相關(guān)酶學(xué)特性測(cè)定，并對(duì)Gox的固定化進(jìn)行了初步的探索研究。
　　本論文通過(guò)構(gòu)建表達(dá)載體pET-24a(+)-Gox和pETM-10-Gox-CBD，經(jīng)大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化獲得目的蛋白重組蛋白L-谷氨酸氧化酶(Gox)和L-谷氨酸氧化酶與纖維素結(jié)合域的融合蛋白(Gox-CBD)。在酶活性研究中發(fā)現(xiàn)，Gox在大腸桿菌異源表達(dá)時(shí)，可形成足夠量的輔基FAD，而且輔基在分離過(guò)程中不易脫落，不需要額外添加。在

3、4℃條件下結(jié)合4h，融合蛋白Gox-CBD充分結(jié)合吸附到結(jié)晶纖維素上的量約為9.0mg/g。對(duì)異源表達(dá)的Gox、游離的Gox-CBD和固定化的Gox-CBD進(jìn)行酶活特性測(cè)定，并進(jìn)行了比較發(fā)現(xiàn)，固定化酶Gox-CBD相對(duì)于重組蛋白Gox的比酶活略有降低，但在熱穩(wěn)定性上固定化酶比游離酶提高了很多，在60℃放置30min后還保留有75％的活性，而游離酶則完全喪失了活性。與此同時(shí)，將破碎的大腸桿菌離心上清液直接進(jìn)行一步純化Gox-CBD的純化實(shí)

4、驗(yàn)操作，SDS-PAGE驗(yàn)證顯示，可以獲得比較純的Gox-CBD。
　　Gox作為黃素酶的一種，它的應(yīng)用范圍較為廣泛。Gox的異源表達(dá)表明:可以通過(guò)大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)有活性的酶蛋白。通過(guò)一步純化操作，可以將融合有纖維素結(jié)合域的L-谷氨酸氧化酶結(jié)合到微晶纖維素上，其操作方便，特異性強(qiáng)，并且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，與重組L-谷氨酸氧化酶相比，其比酶活無(wú)明顯變化。通過(guò)融合表達(dá)Gox的方法，并對(duì)固定到纖維素上的L-谷氨酸氧化酶酶學(xué)特性進(jìn)行了初步的探