固定化粘紅酵母細(xì)胞制備L-苯丙氨酸的研究.pdf

1、L-苯丙氨酸(L-Phe)是具有生理活性的芳香族氨基酸，是人和動物必需的氨基酸之一。其主要用于功能性食品添加劑阿斯巴甜的生產(chǎn)。目前，由于國內(nèi)氨基酸大輸液和抗癌藥的開發(fā)利用，特別是對糖精生產(chǎn)實(shí)行限制，阿斯巴甜需求量激增，L-Phe的市場需求也相應(yīng)增加。 本文利用固定化粘紅酵母細(xì)胞，以苯丙氨酸解氨酶(PAL)/肉桂酸途徑制備L-Phe。并對固定化條件、固定化細(xì)胞部分酶活性質(zhì)、效應(yīng)因子和戊二醛化學(xué)修飾對固定化細(xì)胞酶活的影響、酶反應(yīng)條件

2、以及固定化細(xì)胞批式反應(yīng)制備L-Phe進(jìn)行了研究。 由本實(shí)驗(yàn)室不同時期保存的10株粘紅酵母菌出發(fā)，經(jīng)過初篩和復(fù)篩，選出高PAL酶活性的RhodotOrula glutinis 06112-8-3菌株，作為本實(shí)驗(yàn)的供試菌。 分別以瓊脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、海藻酸鈣作為粘紅酵母細(xì)胞固定化的載體材料，通過對固定化后酶活回收率、載體機(jī)械強(qiáng)度等因素進(jìn)行考察，最終確定聚丙烯酰胺作為本實(shí)驗(yàn)固定化細(xì)胞的載體材料。 對固定化過程中

3、的單體濃度、交聯(lián)劑濃度、包埋濃度、包埋時間進(jìn)行了單因素考察，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考，用響應(yīng)面法對固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，用Plackett-Burman法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對以上四個影響因素進(jìn)行了評價，并篩選出顯著影響因素--單體濃度和包埋濃度，第2步用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近以上兩因素最優(yōu)水平。最后由中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面分析確定主要影響因素的最佳條件。固定化粘紅酵母細(xì)胞的最優(yōu)包埋條件為：單體濃度：16.7％；包埋濃度：43％；交聯(lián)劑濃度：2.0％；

4、包埋時間：45min。在此條件下得到的固定化細(xì)胞酶活保留率可達(dá)63％，較優(yōu)化前提高了31％。 考察了固定化細(xì)胞的部分酶學(xué)性質(zhì)，并與游離細(xì)胞進(jìn)行了對比。在熱穩(wěn)定性方面，固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞基本一致，40℃保溫時酶活較穩(wěn)定，60℃保溫條件下，酶活迅速喪失。對比反應(yīng)時程曲線發(fā)現(xiàn)，固定化細(xì)胞的最大反應(yīng)速率出現(xiàn)在4hr～8hr之間，較游離細(xì)胞出現(xiàn)了延滯。固定化后的細(xì)胞酶活穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)，連續(xù)進(jìn)行5個批次轉(zhuǎn)化反應(yīng)后仍保持一定的催化活性，而游

5、離細(xì)胞第二次使用時酶活已經(jīng)顯著降低。 固定化細(xì)胞中添加效應(yīng)因子--山梨醇(a=18:1)，使用0.05％的戊二醛溶液后處理固定化細(xì)胞都可使固定化細(xì)胞酶活提高。二者聯(lián)合使用使固定化細(xì)胞的酶活保留率和酶活穩(wěn)定性大大提高。 通過對固定化細(xì)胞酶反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最優(yōu)的酶反應(yīng)條件：pH為ll的底物轉(zhuǎn)化液體反應(yīng)混合物中，NH4+濃度3.0mol/l，底物肉桂酸的濃度為13g/l，反應(yīng)溫度為30℃。 初步研究了固定化細(xì)胞半連

6、續(xù)批式轉(zhuǎn)化肉桂酸制備L-Phe。固定化細(xì)胞經(jīng)過10個批次的轉(zhuǎn)化反應(yīng)，大約有4.78g的肉桂酸在0.1L的半連續(xù)批式生物反應(yīng)器中被固定了20g濕細(xì)胞(收獲自1L搖瓶液體培養(yǎng)物)的固定化細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化，積累生成了5.33g的L-Phe；相當(dāng)于在液體反應(yīng)混合物中L-Phe的積累濃度達(dá)到了53.3g/l。這與該菌株的中試整細(xì)胞一次批式轉(zhuǎn)化工藝水平30 g/l比較，產(chǎn)率提高了1.8倍。生物轉(zhuǎn)化參數(shù)再進(jìn)行進(jìn)一步工藝優(yōu)化，本非糧途徑的酶法制L-Phe仍