金屬元素標記結合質譜技術的蛋白質組多重定量新方法研究及應用.pdf

1、發(fā)展蛋白質組多重定量技術以精確測量多個不同生理或病理條件下的生物樣本蛋白質組表達及翻譯后修飾的量的變化,從而發(fā)現潛在的生物標志物和具有重要生物學意義的關鍵蛋白質,是當前蛋白質組學的研究熱點。已發(fā)展的基于穩(wěn)定同位素標記的蛋白質組多重定量方法,如iTRAQ標記方法,可以實現對蛋白質組的多重定量分析,但仍存在許多不足,如標記試劑制備困難,價格昂貴,對質譜分析儀器具有選擇性,定量的準確性有待提高等。因此發(fā)展更加精確且價廉易得的蛋白質組定量方法和

2、技術仍是當前蛋白質組學研究的重要目標和極具挑戰(zhàn)性的任務之一。
　　金屬元素標記蛋白質組定量方法是近年來發(fā)展的一種新方法,拓展了蛋白質組定量的新思路。與穩(wěn)定同位素標記方法相比,金屬元素標記方法具有很多自身的特點:如制備金屬標簽的試劑價廉易得;可供選擇的稀土金屬元素多,具有發(fā)展成多重金屬標記技術的可能性;具有與生物質譜技術和元素質譜技術聯用,應用于蛋白質組相對和絕對定量的雙重優(yōu)勢等。
　　本文旨在建立價格相對低廉、定量穩(wěn)定可靠的

3、,應用于蛋白質組學的多重定量新方法?；诖?我們首次建立了標記肽段N-端的金屬元素標記結合生物質譜技術的蛋白質組多重相對定量新方法及應用研究。
　　首先,本研究選擇大環(huán)化合物四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)的四種鑭系金屬(Tb,Ho,Tm和Lu)螯合物作為金屬元素螯合標簽(Metal Element Chelated Tag,MECT),并全面考察了影響金屬元素標記反應的各種影響因素。通過四氮雜環(huán)十二烷四乙酸琥珀酰亞胺活化酯(DO

4、TA-NHS-ester)與肽段胺基的共價鍵合反應,然后與四種鑭系金屬離子的螯合反應進行標記。在優(yōu)化的反應條件下,標準合成肽段的金屬元素標記效率高達99％,對騰沖嗜熱菌樣本的全蛋白胰酶酶解肽段也能實現高效率的標記,表明金屬元素標記具有溫和、穩(wěn)定、高效和無肽段歧視的優(yōu)點。
　　其次,本研究建立了金屬元素標記與基質輔助激光解吸附電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術結合的蛋白質組多重相對定量新方法。以標準合成肽段和標準蛋白

5、質為模型的研究結果表明:該方法在5倍的動態(tài)范圍內有良好的線性相關性(R2=0.99),較小的相對標準偏差(RSD≤13%)和合理的蛋白質多重相對定量準確性。而且,金屬元素標記肽段在酸性介質下具有良好的穩(wěn)定性。通過對金屬元素標記肽段的質譜裂解行為的研究,發(fā)現金屬標簽在二級碎裂過程中十分穩(wěn)定,碎片離子主要為連續(xù)的y離子和部分b離子,因而有利于未知肽段的定性鑒定,適于復雜生物樣本的分析。
　　然后,本研究建立了基于ESI-MS技術的金屬

6、元素標記蛋白質組多重相對定量新方法。先胍基化肽段的賴氨酸側鏈氨基,僅對N-端氨基進行金屬元素標記,然后結合ESI-LTQ-FT-MS/MS進行四重相對定量分析。通過對四重金屬元素標記肽段的色譜-質譜行為考察,結果表明四重金屬元素標記肽段具有相同的色譜保留和二級質譜裂解行為。與肽段原型相比,金屬元素標記肽段的二級質譜碎片離子中,除連續(xù)的y-系列離子外,b系列離子的信號得到改善,提高了未知肽段定性鑒定的可靠性。以標準肽段和標準蛋白質混合物為

7、模型的相對定量研究結果表明:該方法在0.1～10倍動態(tài)范圍內的線性關系良好(R2=0.99),在10倍差異內,對六種標準蛋白質混合物的四重相對定量的百分比誤差為13%,標準偏差(SD)為9%,相對標準偏差(RSD%)在20%以內,表明該定量方法具有良好的準確性、重復性和精密度,顯示了該定了方法在復雜生物樣本的良好的應用價值。
　　最后,本研究將金屬元素標記結合納升源反相高效液相色譜-電噴霧-線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振串聯質

8、譜(nano-RP-HPLC-LTQ-FT-MS/MS)技術的多重相對定量策略初步應用于四個不同溫度培養(yǎng)的騰沖嗜熱菌蛋白質組的相對定量研究。通過MaxQuant軟件定性鑒定和定量計算,在99%置信度和至少兩個非冗余肽段定量一個蛋白質的條件下,共發(fā)現差異表達顯著(倍數<0.5或>2)的13個蛋白質,其中8個蛋白質隨著騰沖嗜熱菌的培養(yǎng)溫度的升高而表達量逐漸上調;相反地,另外5個蛋白質的表達量呈下調趨勢。13個差異蛋白中有7個蛋白質與文獻報道