奶山羊胎盤肽的分離提純及其對小白鼠免疫功能的影響.pdf

1、自1985年，劉月新首次采用“勻漿一透析法”提取胎盤肽以來，廣大科研工作者對胎盤肽進(jìn)行了大量的理化分析與生物活性測定的研究，發(fā)現(xiàn)其在臨床用于治療病毒性肝炎、白細(xì)胞減少癥、重癥肌無力等免疫性疾病以及惡性腫瘤等，有較為理想的療效。奶山羊胎盤的結(jié)構(gòu)和功能與人的胎盤有許多相似之處，近幾年來已有報(bào)道，從羊的胎盤中也可以提取出羊胎盤肽并且具有與人胎盤肽類似的生物學(xué)活性。但是對奶山羊胎盤肽的研究還沒有，測定其理化性質(zhì)和生物活性，看其與人胎盤肽的活性是

2、否一致。可以為奶山羊胎盤肽的研究和將其用于治療動(dòng)物或人疾病方面提供一定的依據(jù)。以前的報(bào)道多集中于經(jīng)透析或超濾制的的混合小肽的活性的研究。本試驗(yàn)將經(jīng)過超濾和superdex75層析對混合小肽進(jìn)行分離，通過檢測各個(gè)組分的生物學(xué)活性來篩選有活性的組分，為下一步的生物合成或化學(xué)合成提供一定的依據(jù)。整個(gè)研究包括兩大部分： 一、奶山羊胎盤肽的分離提純和含量測定 將冷凍的奶山羊胎盤常溫解凍，洗凈血液后用生理鹽水沖洗胎盤，取胎盤的子葉，

3、將子葉剪碎，經(jīng)過反復(fù)凍融，經(jīng)高速組織搗碎勻漿機(jī)勻漿，高速冷凍離心機(jī)離心沉淀，取上清液分別用0.45μm、0.22μm的濾器進(jìn)行微濾，以除去不溶物質(zhì)；微濾液經(jīng)MilloporYM-10型超過濾器過濾得到粗樣品，粗樣品是無色透明液體，具有可透析性，可超濾性，無熱原的小分子多肽，pH值為6.6～6.9；粗樣品經(jīng)superdex75層析得到四個(gè)組分肽類，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，冷凍干燥后均為白色的粉末；四組分經(jīng)加脲和甘油Tricine-SDS-P

4、AGE.電泳法電泳。結(jié)果顯示組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的分子量分別為10.139KDa、8.166KDa、7.447KDa和6.761KDa；由考馬斯亮藍(lán)G-250法測定組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量分別為：0.96mg/g、1.2mg/g、1-32mg/g、1.8mg/g。 二、奶山羊胎盤肽對小白鼠免疫功能的影響 本實(shí)驗(yàn)將小白鼠隨機(jī)分為6大組，其中5組為實(shí)驗(yàn)組(分別腹腔注射組分：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和粗提物)：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組又分為高中低三種劑

5、量小組(分別為0.1mL，、0.2mL、0.4mL)，每小組5只；對照組5只，僅注射生理鹽水。每天注射一次，連續(xù)注射一周。通過對小鼠外周血血清白介素2含量、脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、僻臟NK細(xì)胞活性和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響來考察奶山羊胎盤肽的免疫活性作用。 1.通過放射性免疫法測定小鼠外周血中IL-2的含量，結(jié)果顯示，組分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以顯著提高小鼠外周血中IL-2的含量，比對照組提高了15.3％～30.1％(p＜0.05)

6、。 2.通過MTT法測定脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，結(jié)果顯示，組分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以在體內(nèi)能極顯著協(xié)同ConA刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖(p＜0.01)。 3.通過MTT法測定脾臟NK細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果顯示，組分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以極顯著提高小白鼠脾臟NK細(xì)胞的殺傷活性(p＜0.01)。 4.通過腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)可知，組分Ⅲ、Ⅳ和粗提物可以極顯著提高小白鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能(p＜0.01)。 由以上奶山