豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素的克隆表達及表達產(chǎn)物對小白鼠的免疫保護性研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種傳染性呼吸道疾病。該病在各年齡階段的豬均有發(fā)生。臨床癥狀以病豬呼吸困難為特征，病理變化主要是肺部不同程度的充血、出血和纖維素性肺炎，該病的發(fā)病率和死亡率常在20％以上，在我國的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。 APP的致病因子較多，包括莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉鐵結合蛋白及溶血毒素(A

2、px)等，其中溶血毒素是最重要的致病因子。研究APP毒力因子的致病作用有利于毒力因子亞單位疫苗或基因工程疫苗的研究，同時對有效疫苗的選擇和應用，預防和控制本病也具有重要意義。 本研究內(nèi)容分兩個部分： 第一部分：豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素的克隆與表達。 參照GenBank已發(fā)表的血清5型胸膜肺炎放線桿菌ApxⅠA基因序列和血清3型胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA基因序列，設計4對引物。對從山東省分

3、離的血清5型和血清3型的放線桿菌進行PCR.擴增，分別得到1095bp、1017bp、1462bp和537bp的目的片段。測序結果表明，分離菌株ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA、ApxⅣA核酸片段基因序列與標準菌株的相應序列同源性達99％以上。將擴增的核酸片段分別克隆入原核表達載體pGEX-5X-3中，然后轉化大腸桿菌BL21，經(jīng)終濃度Immol/L的IPTG誘導2h后，SDS-PAGE結果顯示，ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅢA和A

4、pxⅣA獲得高效表達，分別得到58kDa、66kDa、82kDa和49kDa的融合蛋白條帶。在Western-blotting中，抗APP血清5型和3型的高免血清能識別這些毒素的蛋白條帶。此檢測結果表明，表達產(chǎn)物具有免疫活性。 第二部分：溶血毒素表達產(chǎn)物的純化及對小鼠免疫保護性的研究。 通過硫酸銨鹽析和SephadexG-200凝膠過濾層析純化表達產(chǎn)物。按照不同組合將表達產(chǎn)物與弗氏佐劑等比例混合，制備3種亞單位疫苗。并在

5、30日齡和45日齡免疫小白鼠，在60日齡分別用血清1、3、5、7和10型胸膜肺炎放線桿菌攻毒。血清1、5和7型胸膜肺炎放線桿菌攻毒后，3種亞單位疫苗分別提供58.4％、66.6％和91.7％的保護率。免疫含四種融合蛋白的亞單位疫苗的小白鼠剖檢可見肺臟，肝臟僅呈現(xiàn)輕微的出血和腫大，病理組織學觀察，肝細胞壞死數(shù)較少，肺泡內(nèi)出血較輕，肺間質輕微增厚。試驗結果表明表達產(chǎn)物具有免疫保護作用，且含有四種表達產(chǎn)物的亞單位疫苗對小鼠的免疫保護效果最佳。